加味温胆汤对抑郁模型大鼠下丘脑神经元超微结构的影响

宋瑞雯，张丽萍，陈颖，徐磊

(天津中医药大学，天津 300193)

抑郁症是一种以情绪持续低落为主要症状的身心疾病，因其病因和发病机制尚不明确、发病率逐年上升及高致残致死率已成为国际精神医学界亟待解决的难题。研究表明：慢性、低强度且长期的应激性生活事件不仅是诱发抑郁症的重要原因[1]，还能导致一系列中枢神经系统可塑性的改变。已有研究表明，下丘脑与情绪反应的关系密切相关，但目前相关研究多集中在应激后大鼠额前皮质区和海马CA1区、CA3区神经结构可塑性方面，尚未见对慢性应激后大鼠下丘脑神经元超微变化的研究[2-3]。课题组前期临床疗效观察证实，加味温胆汤对抑郁症患者情绪低落、睡眠障碍、食欲不振等症状具有良好疗效，且胃肠道不适等副作用显著低于西药氟西汀[4-5]；前期机制研究发现，本方可改善抑郁模型大鼠海马CA3区超微神经元结构萎缩[3]。本研究在前期临床疗效、作用机制研究的基础上，进一步分析加味温胆汤对慢性应激抑郁模型大鼠下丘脑神经元超微结构变化的影响，以期进一步阐释加味温胆汤抗抑郁的病理形态学基础。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD大鼠，雌雄各半，8周龄，体质量(200±20)g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，生产合格证号 SCXK(军)2014-4401。

1.2 药物及试剂

加味温胆汤由竹茹、半夏、枳实、陈皮、远志、合欢花、茯苓和郁金等药物组成，均购买于天津同仁堂药店，经传统水煎法制备浓缩浸膏；盐酸氟西汀片(美国礼来公司，20 mg/粒) ，使用前双蒸水配制成药液。

1.3 仪器及试剂

自制旷场实验箱，日本日立H-7500透射电子显微镜，徕卡UC-7超薄切片机，德国 EPPENDORF移液器。3%多聚甲醛、4℃预冷1%戊二醛，37℃预热0.9%生理盐水，10%水合氯醛、4%戊二醛、输液器由赛东南试剂公司提供。1/15M磷酸缓冲液、1%四氧化锇、丙酮、包埋液、醋酸双氧铀、柠檬酸铅由河北医科大学电镜实验中心提供。

2 方法

2.1 实验分组及给药

参照随机数字表法将32只SD大鼠随机分为4组：空白组、模型组、氟西汀组(简称西药组)和加味温胆汤组(简称中药组)。空白组每日正常进水、进食，每笼8只；其余3组1只/笼，连续造模3周后，模型组灌胃给予生理盐水2 mL/(kg·d)，西药组灌胃给予氟西汀溶液1.8 mg/(kg·d)，中药组灌胃给予加味温胆汤煎剂12 g/(kg·d)，每日早晨8：00开始，持续给药4周。

2.2 动物模型制备

除正常组外，其余各组持续3周接受9种未预知的应激刺激，分别是：24 h禁食，24 h禁水，夹尾1 min，悬尾1 min，通宵照明，45℃烘箱热烘5 min，4℃冷水游泳5 min，高速水平振荡鼠箱3 min，100伏交流电电击足底1 min。3周内逐日随机给予1～2种刺激，期间每种刺激方式出现不少于2～3次，但同一种刺激不可持续出现，使动物不能预知每日即将给予的刺激方式。

2.3 观察指标

2.3.1 体质量变化

造模前、造模3周及给药4周后分别称取大鼠体质量，计算各组大鼠的体质量增长数(△W)，比较各组大鼠体质量变化趋势。

△W1=W(造模3周后体质量)-W(造模前体质量)

△W2=W(给药4周后体质量)-W(造模3周后体质量)

2.3.2 旷场试验

以大鼠四爪均进入方格内穿越旷场试验箱底面格子数计为水平活动得分；以大鼠两前爪腾空或攀爬于墙壁使全身直立记为垂直活动得分，两者总和为旷场试验得分。分别测定各组大鼠造模前、造模3周后及给药4周后水平活动得分和垂直活动得分，计算各组大鼠旷场试验总分，3 min/次，比较各组大鼠旷场试验变化趋势。

2.3.3 透射电镜

糖水实验、旷场试验结束后每组随机选取4只大鼠，腹腔麻醉大鼠，心脏灌注内固定液，取2～3块大小为1 mm×1 mm×1 mm的下丘脑组织标本，4%戊二醛固定至少2 h，1%四氧化锇后固定2 h，梯度丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，烤箱60℃固化48 h，超薄切片机将下丘脑样品切成厚约50 nm的切片，醋酸双氧铀浸泡45 min，柠檬酸铅浸泡30 min，进行电子染色。置于透射电镜下观察下丘脑神经元超微结构的变化，包括细胞核、线粒体、粗面内质网、高尔基体等情况。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 体质量变化情况

造模3周后：与空白组比较，模型组、西药组和中药组体质量增长数有明显统计学差异(P<0.01)；模型、西药、中药组之间对照，体质量增长数无明显统计学差异(P>0.05)。

给药4周后：与空白组比较，模型组体质量增长数减少有显著统计学差异(P<0.01)；与模型组对照，西药组和中药组体质量增长数有统计学差异(P<0.05)；西药组和中药组组间相对比，体质量增长数无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量增长数结果比较

注：与空白组比较，△P<0.01；模型组比较，▲P<0.01，▲▲P<0.05

3.2 旷场试验

造模3周后：与空白组相比，模型组、西药组和中药组中药组旷场试验得分有显著统计学差异(P<0.01)；模型组、中药组和西药组3组之间旷场试验得分无明显统计学差异(P>0.05)。

给药4周后：模型组与空白组相比，旷场试验得分有明显统计学差异(P<0.01)；中、西药组之间对比，旷场试验得分无明显统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，中药组和西药组旷场试验得分有明显统计学差异(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠旷场试验运动得分比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

3.3 电镜观察结果

正常组大鼠神经元线粒体结构基本完整，嵴排列规则，基质密度正常，粗面内质网排列整齐，膜表面分布大量核糖体。模型组：电镜下超微形态变异较明显，细胞体肿胀变性，线粒体存在不同水平的肿胀、线粒体膜、嵴产生溶解和断裂现象，线粒基质分布不匀、电子密度下降，严重者呈现融合消散征象；粗面内质网的数量减少，并出现不规则扩张、折叠、断裂、盘曲、细胞空化，膜结构明显破损。中药组和西药组下丘脑神经元结构接近正常状态，细胞核内异染色质增加程度较轻，核边缘光滑，核周间隙较为正常；较少数线粒体形态轻度肿胀，基质分布较均匀，电子密度略增加；粗面内质网和高尔基体正常，与模型组比，神经元受损程度明显减轻。如图1。

图1 电镜下各组大鼠神经元结构

4 讨论

目前，已有较多的国内外文献报道神经系统可塑性变化与应激反应关系密切，且以往文献对应激后中枢神经可塑性变化的研究大多集中在大鼠海马与额前皮质两部位，电镜下观察可见：大鼠接受应激刺激后，额前皮质区突触前膜的突触囊泡密度和突触后膜的致密物厚度均会降低，出现异常的突触超微形态结构[2]；慢性应激性抑郁可导致大鼠海马CA1区神经元突触可塑性发生改变[3-4]，证实了慢性应激的确可以造成中枢神经系统产生可塑性变化。下丘脑作为中枢神经系统中调节内脏活动的高级中枢，下丘脑可塑性与应激的关系也已得到了的证明：光镜下，与对照组比较，慢性应激大鼠下丘脑神经细胞间隙减少，空泡减少，排列略紊乱，细胞质染色加深，核增大、色深[6]。可见，慢性应激使大鼠下丘脑一般结构发生了变化，但其超微结构变化相关研究尚未见报道，严重制约了深入研究下丘脑神经可塑性在抑郁症发生发展过程中的作用机制。

鉴于此，本实验在前期工作基础上，进一步探讨中药复方加味温胆汤对慢性应激模型大鼠下丘脑神经元超微结构的影响。行为学表明：造模3周后，与正常组对照，体质量增长数和旷场试验得分上，模型、西药和中药组具有显著统计学差异(P<0.01)，而模型、西药和中药组之间得分无统计学差异(P>0.05)，说明抑郁模型制备成功；给药4周后，与正常组比较，模型组大鼠的体质量增长数、旷场实验得分显著下降(P<0.01)，与模型组比较，中药组和西药组大鼠体质量增长数、旷场实验得分显著增加(P<0.01)。透射电镜结果显示：与正常组比较，模型组大鼠电镜下下丘脑神经元严重受损，超微形态结构发生显著改变；与模型组比较，中药组和西药组的线粒体、粗面内质网虽然受损，但下丘脑神经元受损程度总体比模型组显著减轻，说明慢性应激可以导致大鼠下丘脑组织线粒体、内质网、糖原颗粒的损伤，使部分细胞出现凋亡改变，这从形态学上证明了慢性应激可诱导大鼠出现下丘脑神经元超微结构改变，加味温胆汤可能是通过减轻抑郁模型大鼠下丘脑神经元超微结构损害而改善抑郁样行为。