诺丽果发酵液抑制肝癌细胞Bel7402增殖及促凋亡作用观察

范海能，苏定志，王谦，冯华诺，张丛，鲁琰，吴英日*

(1.中国人民武装警察部队三亚疗养院，海南 三亚 572000；2.海南省卫生学校，海南 海口 570311；3.海南医学院，海南 海口 571199)

诺丽(Noni)，学名Morinda citrifolia，又称海滨木巴戟、海巴戟天、诺尼，属茜草科巴戟天属植物，诺丽主要生长在南太平洋群岛，在我国主要分布在台湾、海南及西沙群岛等地。

诺丽果在波利尼西亚地区已有两千多年的历史，目前在国外已是一种常见的食物。有研究发现[1-3]，诺丽果富含20多种氨基酸、维生素C、多糖、环烯醚萜、蒽醌类等多种有效成分，具有体外抗肿瘤、抗氧化、抑菌消炎等活性[4];诺丽叶含有黄酮、皂甙、多糖等活性成分，种子含有甾醇类、东莨菪亭[5-6]等活性成分。目前，诺丽果已被应用于许多领域。例如：抗癌、抗炎、抗氧化以及保护人体器官等[7-9]。

肝癌(HCC)是全球第五大癌症，而其死亡率却居全球第三。其中50%以上的肝癌患者分布在中国内地[10]。据统计，我国每年死于肝病的人数是30万，其中约有11万人死于肝癌[11]，肝癌已经成为我国严重的健康问题。所以寻找肝癌特效的治疗药物成为了亟待解决的问题。近年来，随着世界范围内“回归自然”浪潮的涌起，人们开始将新药研发的目光转向天然抗肿瘤药物上，特别是一些天然抗肿瘤药物的发现，极大地鼓舞了科学家们从天然产物中创制抗肿瘤新药的信心。

作为一种广为流传的药用植物,诺丽果已经被应用于治疗流感、糖尿病、高血压、肿瘤等[12-16]。但是关于诺丽果对肝癌的影响等方面的研究目前尚未见报道，那么它对肝癌的增殖和凋亡是否有影响呢？以及其具体的分子机制又是如何呢？这引起了我们极大地兴趣。所以本研究在体外用诺丽果发酵液处理肝癌Bel7402细胞，探讨诺丽果发酵液对肝癌细胞的增殖和凋亡情况的影响。为下一步研究诺丽果发酵液组份对肝癌细胞凋亡的影响和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试药

超净工作台(上海苏净实业有限公司);CO2恒温培养箱(上海迅能电热设备有限公司);发酵罐(温州市亿一机械有限公司);倒置显微镜(日本奥林巴斯);酶标仪(美国伯乐iMark);流式细胞仪(BD FACSCalibur)。

胎牛血清(批号:13011-8611)购自杭州四季青生物公司;DMEM培养液(批号:12100)、MTT试剂盒(批号:M1020)购自索莱宝生物技术有限公司;二甲基亚砜(批号:A100231 )购自上海生工生物技术有限公司;细胞凋亡检测试剂盒(批号:C1062)、DAPI染色液(批号:C1005)购自上海碧云天生物技术有限公司;人肝癌细胞 Bel7402细胞株购于中国科学院上海细胞库。

1.2 诺丽果发酵液的制备

取5 kg新鲜成熟的诺丽果于发酵罐中，密封室温自然发酵40 d取汁，过滤取清液，最后用0.22 μm的滤膜过滤后-20℃保存待用，参照文献[2,17]，在临用前用培养基稀释发酵液。取7.5 mL发酵原液加入细胞培养基定容到10 mL即为75%的发酵液，取5 mL发酵原液加入细胞培养基定容到10 mL即为50%的发酵液。发酵液原液即为100%的发酵液。

1.3 细胞培养

肝癌细胞Bel7402培养于10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4 MTT测细胞增殖抑制率

取对数生长期的人肝癌细胞Bel7402，胰酶消化后调整细胞浓度为 2×105/mL，制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养过夜待细胞贴壁。空白对照组加入20 μL DMEM培养基，实验组每孔加入20 μL浓度分别为50%、75%、100%的诺丽果发酵液药液，每组设5个平行复孔。药物作用24 h、48 h后，每孔加入浓度为 5 g/L 的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，吸去培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡5 min，使结晶物充分溶解。酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度。按照公式

1.5 流式细胞仪分析细胞凋亡情况

取对数生长期的人肝癌细胞Bel7402，胰酶消化后调整细胞浓度为2×105/mL，制成单细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2 mL，培养过夜待细胞贴壁。然后将培养液加入400 μL不同浓度的诺丽果发酵液，药物作用72 h后，收集全部细胞，PBS洗涤2次，先加入400 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入Annexin V-FITC和PI各10 μL，避光孵育15 min，流式细胞仪检测荧光强度，计算凋亡细胞的百分率。

1.6 DAPI染色检测细胞凋亡情况

将Bel7402细胞按1×105个每孔的密度接种于预先放有盖玻片的24孔板中，每孔1 mL培养基，分为2组，每组3个孔。培养24 h后，向孔中加入200 μL诺丽果发酵液原液。培养48 h，取出盖玻片，PBS反复洗涤3次，再加入0.5 mL固定液固定2 h，PBS继续洗涤2次。再加入0.5 mL DAPI染色液，染色15 min。倒置荧光显微镜下观察各组细胞核形态并拍照记录。

1.7 Western blotting检测Survivin基因的表达

将Bel7402细胞按1×105个每孔的密度接种于24孔板中，每孔1 mL培养基，分为2组，每组3个孔。培养24 h后，向实验组各孔中加入200 μL诺丽果发酵液原液。培养48 h后加入100 μL蛋白裂解液4℃裂解30 min，12 000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清进行蛋白定量。总蛋白加入上样缓冲液后100℃变性10 min。取50 μg样品总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭后加入1∶1 000稀释的Survivin单克隆抗体4℃孵育过夜。次日洗膜后再加入羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后化学发光显影。

1.8 统计学方法

2 结果与分析

2.1 诺丽果发酵液对Bel7402增殖的抑制作用

MTT结果显示,浓度为50%、75%、100%的诺丽果发酵液药液作用于肝癌细胞Bel7402后肝癌细胞的增殖均受到不同程度的抑制，且抑制效率呈明显的剂量依赖关系(见表1)。这说明诺丽果发酵液在体外能够抑制肝癌Bel7402细胞的增殖。

表1 诺丽果发酵液对Bel7402增殖的抑制率

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 流式细胞仪分析细胞凋亡情况

图1a是流式细胞仪检测的细胞凋亡情况，其中每张图的左下象限代表正常细胞群，右下象限代表早期凋亡细胞群。图1b是由细胞凋亡比例生成的数据直方图，从图中我们可以发现与对照组相比，实验组凋亡率显著升高，同时诺丽果发酵液作用Bel7402细胞后，细胞凋亡比例随着发酵液浓度的升高细胞凋亡率也出现了明显的上升趋势。这说明诺丽果发酵液在体外能诱导肝癌Bel7402细胞凋亡，并且细胞凋亡率与发酵液浓度密切相关。

注：A.对照组肝癌细胞;B.经浓度为50%的发酵液处理过的肝癌细胞;C.经浓度为75%的发酵液处理过的肝癌细胞;D经浓度为100%的发酵液处理过的肝癌细胞;与空白对照组比较，*P<0.05图1 诺丽果发酵液对Bel7402细胞凋亡情况的影响

2.3 DAPI染色法检测细胞凋亡情况

细胞经DAPI染色后在显微镜下观察发现，对照组细胞贴壁良好，呈多角形(图2A)；而被诺丽果发酵原液(100%发酵液)处理48 h后，细胞贴壁数量较少，形态明显变圆，出现细胞破碎等损伤现象(图2B)。在荧光显微镜下，对照组细胞核形态正常，显蓝色荧光，核轮廓清晰，呈椭圆形(图2C)；而给药组细胞出现明显的凋亡特征，细胞核碎裂，可见凋亡小体(图2D)。

注：A-D分别代表白光下对照组细胞、发酵液处理组细胞、荧光下对照组细胞核情况以及发酵液处理组细胞核情况图2 DAPI染色法检测细胞凋亡情况

2.4 Western blotting检测Survivin基因表达

Western blotting检测结果显示诺丽果发酵液原液(100%发酵液)处理肝癌细胞Bel7402 48 h后细胞的抗凋亡基因Survivin的表达量与对照组相比明显降低(见图3)。

注：A.对照组;B.发酵液处理组图3 Western blotting分析诺丽果发酵液对Survivin基因表达结果

3 结论与讨论

肝癌是世界上常见的五大恶性肿瘤之一，它的发生和发展不仅与肝癌细胞的异常增殖和分化有关，还与肝癌细胞凋亡的减少密切相关。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤药物治疗的主要策略[15]。

诺丽果作为一种广为流传的药用植物已经被应用于治疗流感、糖尿病、高血压等。这些功能都被传统医学和现代科学研究所证实。有文献报道[14]诺丽果提取物能够抑制肿瘤细胞增殖。但是关于诺丽果发酵液对肝癌的影响等方面的研究目前尚未见报道。本文选择抗菌抗炎症反应效果最显著的诺丽果发酵液[16-18]在体外处理肝癌Bel7402细胞，利用MTT法测定不同浓度诺丽果发酵液对Bel7402细胞增殖的影响，流式细胞分析以及DAPI染色法检测诺丽果发酵液作用后的细胞凋亡情况。结果发现诺丽果发酵液能显著抑制肝癌细胞Bel7402的增殖，流式细胞分析以及DAPI染色法检测发现诺丽果发酵液作用Bel7402细胞后，细胞凋亡比例显著增多且成浓度依赖性。这说明诺丽果发酵液在体外能抑制肝癌Bel7402细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一员，在癌组织中表达水平显著升高。Survivin能够调控细胞凋亡的进程，是非常强大的凋亡抑制因子[19]。本实验利用Western blotting技术分析了诺丽果发酵液对肝癌细胞抗凋亡基因Survivin 表达的影响。结果发现诺丽果发酵液原液处理肝癌细胞Bel7402后，细胞的survivin基因表达量与对照组相比明显降低，这说明诺丽果发酵液在体外诱导肝癌细胞凋亡的机制可能是抑制了Survivin基因的表达。这些实验结果为下一步研究诺丽果发酵液组份对肝癌细胞凋亡的影响及机制等奠定良好的基础。目前本研究只涉及体外诺丽果抗肿瘤作用的药效学研究，对于其抗肝癌的分子机制和作用机理以及运用现代药理学分析方法开展体内水平的研究将是我们下一步工作的方向。这些研究将逐步阐明诺丽果抗肿瘤的分子机制，将对这些天然抗肿瘤药物从实验室研究走向临床应用起到积极的推动作用。