Aβ1⁃42寡聚体对小鼠神经胶质细胞D1a IL⁃1β表达水平的影响研究

王鼎，李晓红，李亚惠（1.大连医科大学第一临床学院，辽宁大连116044；.大连医科大学附属友谊医院，辽宁大连116001）

阿尔茨海默病（AD）又称老年性痴呆，是老年人群常见的中枢神经系统变性病之一，主要临床表现包括渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等。近年来，AD发病率逐渐升高，且患者病死率随着年龄增加逐步增高[1]。AD神经病理学改变主要包括脑组织中存在大量的β-淀粉样蛋白（Aβ）构成的老年斑，以及神经细胞内出现由tau蛋白过度磷酸化和聚集形成的神经原纤维缠结[2]。AD发病原因及机制尚未完全明确。炎症因子通过诱发脑组织炎性反应，进而诱发AD，可能是其发病机制之一[3-5]。白细胞介素（IL）-1是重要的炎症因子，其家族包括IL-1α、IL-1β、IL-18及IL-1受体蛋白拮抗剂等，其中IL-1β与AD关系密切。IL-1β主要由神经胶质细胞产生和释放，通过作用于其他细胞发挥生物学效应，最终引起神经病理学改变，促进AD发生、发展[6]。细胞外的Aβ可通过激活神经胶质细胞内的信号转导途径导致一系列的炎性反应，进而诱发AD[7]。然而，Aβ是否可以促进神经胶质细胞释放IL-1β尚未明确。小鼠神经胶质细胞D1a具有星形胶质细胞的特征，活化后可通过分泌炎症因子参与局部免疫反应。因此，本研究以D1a细胞为研究对象，结合形态学及分子生物学方法，分析了 Aβ1～42 寡聚体（Aβ1-42）与 IL-1β的相关性，旨在确定Aβ对神经细胞的毒性作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Allegra X-30R型低温离心机（Beckman Coulter公司，美国），Mini-ProteinⅡ型电泳仪、iMark型酶标仪、Gel Doc 2000型凝胶图像分析系统（Bio-Rad公司，美国），CO2培养箱（ThermoFisher公司，美国），TCSSP8型荧光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）。

1.1.2 试剂 Aβ1-42寡聚体（Sigma公司，美国），小鼠βactin、IL-1β 抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），Alexa Fluor®488羊抗鼠IgG抗体（Abcam公司，美国）。胎牛血清、Dulbecco′s改良Eagle培养基（DMEM）/高糖培养基（Invitrogen）、胰蛋白酶（Invitrogen公司，美国），二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司，美国），聚偏二氟乙烯膜、标准蛋白标记物（New England Biolabs公司，美国），一抗剥脱液、抗荧光淬灭剂（上海碧云天生物技术有限公司，中国上海），XAR胶片及曝光、显影系统（OneXyi公司，加拿大）。二辛可宁酸（BCA）法蛋白检测试剂（康为世纪生物科技有限公司，中国北京），电化学发光法（ECL）蛋白检测试剂盒（Pierce公司，美国），实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测试剂盒（Omega、Promega公司，美国），霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（S-P）超敏鼠/兔IgG检测试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，中国福州）。D1a细胞由笔者所在实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与处理 根据噻唑蓝（MTT）实验结果，确定Aβ1-42寡聚体处理细胞最适浓度为0.2 μg/mL。因此，将D1a细胞分为对照组和Aβ1-42寡聚体处理组。对照组给予2 μL DMSO处理。Aβ1-42寡聚体处理组给予Aβ1-42寡聚体处理，Aβ1-42寡聚体终浓度为 0.2 μg/mL。各组细胞药物处理时间均为24 h。采用标准6孔板进行细胞接种、培养和处理，每组3孔，且处理实验重复3次。

1.2.2 蛋白检测 （1）蛋白免疫印迹法（Western blot）检测：以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞后，刮取细胞至灭菌的离心管中，4℃、10 000r/min离心5 min，弃上清，按比例加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h；4°C、15 000 r/min离心15 min，取上清用于蛋白检测。以10%十二烷基环酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白检测样品，4℃转膜过夜，5% 脱脂奶粉封闭，IL-1β 抗体（1∶200）4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL检测后进行XAR胶片曝光、显影。洗膜重新封闭后，β-actin抗体（1∶10 000）4°C 孵育过夜，二抗室温孵育 2 h，胶片曝光显影。以β-actin作为蛋白检测参照标准。（2）免疫荧光染色和激光共聚焦扫描检测：PBS冲洗细胞，4%甲醛固定30 min，0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）处理30 min，室温下加入羊血清预孵育30 min，IL-1β抗体（1∶200）4°C 孵育过夜。pH7.4、0.01mol/L PBS冲洗后，以羊抗兔 IgG 抗体（1∶200）室温孵育 1 h，封片，激光共聚焦扫描显微镜下观察结果并拍照。另采用4，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）进行细胞核染色。

1.2.3 mRNA检测 标准方法提取处理细胞总RNA，采用qRT-PCR检测试剂盒进行IL-1β mRNA检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料组间两两比较采用t检验。检验水准α=0.05，双侧检验，P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蛋白和mRNA检测结果 Western blot检测结果显示，与对照组相比，Aβ1-42寡聚体处理组D1a细胞IL-1β蛋白表达水平明显升高。qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，Aβ1-42寡聚体处理组D1a细胞IL-1β mRNA表达水平明显升高（P＜0.05），见图1。

2.2 激光共聚焦检测结果 激光共聚焦检测结果显示，Aβ1-42寡聚体处理组IL-1β表达水平高于对照组（P＜0.05），见图2。

3 讨 论

目前，AD发病原因及机制尚未明确，脑组织慢性持续性炎性反应可导致神经组织病理学改变，因此被认为是诱发AD和疾病持续进展的主要因素[8]。在多种因素的作用下，机体产生和释放大量炎症因子，诱发非特异性炎性细胞浸润和慢性炎性反应，进而诱发AD。值得注意的是，炎性反应同时可引起Aβ在脑组织中大量沉积并逐渐形成老年斑，而老年斑的沉积最终使脑组织急性损伤转变为慢性损伤，最终导致中枢神经系统损伤。因此，抑制炎症因子的产生和释放、拮抗Aβ参与炎性反应对AD的防治十分重要。

图1 Western blot与qRT-PCR检测结果

图2 激光共聚焦检测结果

存在于脑组织细胞外的Aβ是脑内淀粉样蛋白前体蛋白（APP）在β-和γ-分泌酶的裂解作用下产生的肽段，通常以单体、二聚体、低聚物和纤维状等多种形式存在，其中纤维状Aβ是主要的神经毒性致病物质。纤维状Aβ大量沉积是AD发病的根本原因[9]。然而，也有研究表明，可溶性Aβ寡聚体也具有较强的神经毒性作用[10-11]。

在早期AD患者及转基因动物脑内，Aβ老年斑沉积可刺激神经胶质细胞活化并立即和Aβ结合，进而降解、清除Aβ老年斑[12]。然而，随着AD病情不断进展，在致炎因素的长期作用下，活化的小胶质细胞分泌IL-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α等炎症因子。此外，星型胶质细胞和小胶质细胞在细胞间炎性反应信号传递过程中相互影响，小胶质细胞在吞噬、清除Aβ老年斑及释放炎症因子的同时，可以激活星型胶质细胞，活化后的星型胶质细胞参与清除Aβ，并同时通过分泌炎症因子抑制小胶质细胞的活性[13]。在神经胶质细胞分泌的炎症因子中，对IL-1的研究较多，已证实在AD患者受损的大脑皮层中，IL-1表达水平显著升高，而且Aβ老年斑周围活化的小胶质细胞IL-1表达水平也升高[14]。IL-1β作为IL-1主要的亚基之一，可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38信号通路，上调β-淀粉样蛋白裂解酶1（BACE1）表达水平，进而加速APP的裂解和促进Aβ沉积[15-16]。IL-1β还可通过活化胶质细胞，诱导炎症因子的产生和释放，产生神经毒性；通过促进tau蛋白的磷酸化，通过MAPK-p38信号通路介导神经纤维缠结[17]。

综上所述，炎性反应在AD发生、发展过程中有着至关重要的作用。Aβ不仅直接介导炎性反应，其持续存在还可活化神经胶质细胞，释放更多的细胞因子参与炎性反应，使AD病理学改变处于恶性循环之中，最后导致AD的发生和发展。本研究以体外实验证实Aβ1-42寡聚体可上调胶质细胞IL-1β表达水平，验证了Aβ1-42寡聚体与神经胶质细胞IL-1β表达水平二者间的相关性，为进一步探索Aβ和炎性反应在AD发生、发展机制中的作用奠定了一定的基础。