HPLC⁃ELSD法测定芪香益肾颗粒黄芪甲苷含量

袁 林，冉丽娟（重庆市万州食品药品检验所404100）

芪香益肾颗粒是由黄芪、人参、大枣、枸杞子等10味中药，经加水煎煮、提取，制得的一种中药复方制剂，具有补气养血、健脾益肾的功效，主要用于气血两虚、脾肾不足肿瘤患者放、化疗时的合并用药，可改善症状，减轻放、化疗引起的白细胞降低、免疫功能低下。黄芪甲苷为芪香益肾颗粒有效成分之一。目前，芪香益肾颗粒检验标准为国家药品标准WS-5496（B-0496）-2014Z。该标准要求采用薄层扫描法进行黄芪甲苷定量检测，相关文献也采用的是薄层扫描法[1]。但薄层扫描法的缺点在于易受薄层板的品质、检测时的环境等因素影响，结果重复性差[2]。本研究采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）进行黄芪甲苷定量测定。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 日本岛津公司LC-20AT型高效液相色谱仪、LTⅡ型ELSD，瑞士梅特勒-托利多公司ME215S型电子分析天平（分度值0.01 mg）、CP224S型电子分析天平（分度值0.1 mg）。Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）购自北京迪马科技有限公司。乙醚、甲醇（分析纯）购自成都市科龙化工试剂厂，正丁醇（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司，水为超纯水，乙醇、氨水购自（分析纯）购自重庆川东化工集团有限公司。芪香益肾颗粒购自重庆天致药业股份有限公司（批号：171003、171101、171201）。黄芪甲苷对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：110781-201314）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 采用Diamonsil C18色谱柱，参考文献[3-9]，经过优化条件，最后确定流动相定为乙腈-水，比例为 35∶65，流速为 1.0 mL·min-1，柱温为 35℃，进样量为10 μL，ELSD漂移管温度为45℃，氮气压力为350 kPa。分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按拟定色谱条件进样。记录色谱图，见图1。

1.2.2 样品溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品20 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备溶液。精密量取上述对照品储备溶液2.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取芪香益肾颗粒，研细，精密称取10 g，置索氏提取器中[10-12]，加乙醚40 mL，加热回流2 h，弃去乙醚液，晾干，加甲醇50 mL，放置过夜，再加甲醇适量，加热回流10 h，回收甲醇并浓缩至干，残渣加水30 mL，略微加热至溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的氨试液振摇提取4次，每次25 mL，弃去氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水溶液，正丁醇溶液蒸干，向残渣中加甲醇适量至溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到供试品溶液。（3）阴性对照溶液的制备：根据该制剂的处方工艺流程，制备不含黄芪药材的阴性样品。

图1 高效液相色谱图

1.2.3 线性范围实验 分别精密量取对照品储备溶液0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、8.00 mL 置 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，各吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，进行线性回归分析。

1.2.4 精密度与重复性实验 取对照品溶液，连续进样6次，每次各10 μL，记录色谱图。取同一批次芪香益肾颗粒（批号：171101）制备的6份供试品溶液，分别进样 10 μL，记录色谱图。

1.2.5 稳定性实验 取供试品溶液1份，分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样，各进样 10 μL，记录色谱图。

1.2.6 加样回收率实验 取相同批次芪香益肾颗粒（批号：171101）混匀，研细，分别称取6份，每份约10 g，分成3组，每组分别添加浓度为0.412 5 mg·mL-1的黄芪甲苷对照品溶液各1.00、2.00、3.00 mL，充分混匀后进样，各进样10 μL，记录峰面积。

1.2.7 供试品及检测 取3批次芪香益肾颗粒（批号：171003、171101、171201），按前述方法制备供试品溶液，按色谱条件进样，得到峰面积，计算黄芪甲苷浓度。

2 结 果

2.1 线性范围 线性范围实验得到线性回归方程：Y=10.543X-5.632 3（R2=0.999 6），检测系统在黄芪甲苷0.196～3.136 mg·mL-1浓度范围内具有良好的线性。

2.2 精密度与重复性 取对照品溶液，连续进样6次，黄芪甲苷峰面积相对标准偏差（RSD）为1.3%，表明检测系统精密度良好。取同一批次供试品溶液6份，分别进样10 μL，记录色谱图，黄芪甲苷峰面积RSD为0.98%，表明检测系统重复性良好。

2.3 稳定性 不同时间点7次上样，黄芪甲苷峰面积RSD为1.6%，表明供试品溶液中黄芪甲苷在24 h内是稳定的。

2.4 加样回收率 平均回收率为94.22%，RSD为1.4%，具体结果见表1。

表1 加样回收实验结果

2.5 供试品检测 批号171003、171101、171201芪香益肾颗粒，黄芪甲苷检测结果分别为0.165、0.173、0.160 mg·g-1。

3 讨 论

3.1 供试品溶液制备条件的选择 供试品溶液制备方法参考了《中国药典（2015年版一部）》中黄芪药材项下的方法[9]，但是进行了改进。有研究显示，使用D101型大孔吸附树脂柱与不使用该柱对黄芪甲苷的分离效果均较好，最终的检测结果相近，所以本研究未使用该柱；因索氏提取法对供试品中黄芪甲苷的提取效果优于直接超声法，杂质峰更少，故本研究采用索氏提取法[10-12]。

3.2 流动相的选择 本研究对乙腈与水的比例进行了多种组合实验，最后根据黄芪甲苷峰形，理论塔板数，与相邻杂峰的分离度，确定乙腈与水的比例以35∶65为最佳。

本研究建立了可用于芪香益肾颗粒黄芪甲苷含量检测的HPLC-ELSD方法，与薄层扫描法相比，该方法具有灵敏度高、操作简便、结果准确可靠的特点，可用于该制剂的质量控制检测。