响应面法优化百香果酸奶的发酵工艺
2018-12-29周鲜娇杨勇捷黄施华潘进权陈蓉饶颖竹
周鲜娇，杨勇捷，黄施华，潘进权，陈蓉，饶颖竹
（岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048）
0 引 言
百香果(Passionfruit)为西番莲科(Passifloraceaee)西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生常绿藤本植物的果实[1,2]，其营养丰富[3]，香气浓郁，口感酸甜，保健功效好，适宜各类人群食用[4]。
酸奶富含各种营养物质、活性物质及活性乳酸菌等，可促进人体肠道内乳酸菌的生长，调节人体肠道中的微生物菌群平衡，改善肠道功能。Tomas-MSJ等[5]和Arakawa等[6]研究发现乳杆菌产生细菌素对致病菌有显著的抑制作用，具有清肠道、降固醇、预防老年人心血管疾病等保健功效。近年来，我国酸奶产业发展迅速，各种果蔬和粮食等口味的风味酸奶[7-10]应运而生，相比于蔬和粮食酸奶，百香果营养丰富和香味独特—百果之香，这使其更适合作为风味酸奶制作的原料之一。百香果酸奶具有色、香、味等口感俱全的特色，其营养也更全面。目前，对于百香果酸奶的研究报道鲜见[3]本研究通过响应面法优化百香果酸奶发酵工艺，旨在分析出百香果酸奶的最优发酵条件，为百香果风味酸奶的研制提供科学的工艺参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
奶粉(伊利牌高蛋白脱脂高钙奶粉)，百香果(市售新鲜紫香百香果),白砂糖；菌粉：川秀乳酸菌酸奶发酵粉（保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为1∶1）。
1.1.2 培养基
MRS肉汤，结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)，煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
1.1.3 仪器设备
SPX-250B-Z生化培养箱，YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器，SW-CJ-2FD洁净工作台，SQP电子天平，BCD-402WDBA海尔冰箱。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程及操作要点
取百香果果肉捣碎，经无菌纱布过滤留汁并杀菌冷却，得百香果果汁；将脱脂奶粉与白糖混合、溶解，并杀菌冷却，得无菌奶液；菌粉用温开水溶解，以备接种。
1.2.2 百香果酸奶制作流程
混匀果汁、无菌奶液→接种→混匀→分装→发酵→4℃冷藏24 h后熟→成品
混匀
1.2.3 单因素实验设计
发酵时间设定为5 h时，分别比较不同奶粉添加量（6 g/100 mL、9 g/100 mL、12 g/100 mL、15 g/100 mL、18 g/100 mL）白糖添加量（5 g/100 mL、7 g/100 mL、9 g/100 mL、11 g/100 mL、13 g/100 mL）、百香果果汁添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、发酵温度（40℃、41℃、42℃、43℃、44℃）和菌粉添加量（1∶500、1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500，均为质量体积比）对百香果酸奶品质的影响。
1.2.4 Plackett-Burman实验设计
在单因素试验的基础上，以百香果酸奶感官评分为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6进行PB试验的设计试验设计如表1所示。
表1 PB试验因素与水平
1.2.5 最陡爬坡实验设计
在PB实验的基础上，对筛选得出的显著因子进行合理设计，从而获得最佳工艺区域的方法，并将此最佳结果作为响应面试验的中心点展开实验[11]。
1.2.6 响应面实验设计
利用Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken实验的设计，设计因素及对应水平如表2所示。
表2 Box-Behnken设计实验因素与水平
1.2.7 酸奶测定项目及标准
1.2.7.1 感官评定
随机邀请10位同学组成鉴评小组，参照国家酸乳卫生标准GB/T19302-2010[12]，根据成品的色泽、滋味、气味、状态等进行综合评分。除去一个最高分和一个最低分后取平均值作为最后感官评分。评分标准如表3所示。
表3 感官指标评定
1.2.7.2 理化和微生物指标
酸度数值以°T表示，具体操作方法见GB/T 5413.34-2010[19]。乳酸菌数≥1×106mL-1，方法详见GB/T 4789.35-2016[23]；大肠菌群（最近似值）≤0.003 mL-1，方法详见GB/T 4789.3-2008[14]。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 百香果果汁添加量的确定
由图1可以看出，百香果果汁添加量对酸奶的品质有明显影响,感官评分随百香果汁添加量的增加呈先升高后降低的趋势。当不添加果汁时，酸奶风味较淡，感官评分为68；当添加量为6%时，酸奶具有百香果独特香味、凝乳好、口感佳，感官评分最高，为84分；当添加量达到8%时，酸奶较粗糙，缺少细腻感，综合品质明显降低。因此，6%的果汁添加量最佳。
图1 百香果果汁添加量对酸奶品质的影响
2.1.2 奶粉添加量的确定
图2表明，脱脂奶粉添加量对酸奶品质的影响很大,感官评分随脱脂奶粉添加量的增加呈先升高后缓慢降低的趋势。奶粉添加量为6%和9%时，酸奶有大量乳清析出，凝乳不均匀；奶粉添加量小于12%时，增加奶粉的添加量可使酸奶更具稠厚感，凝乳更均匀，口感更细腻，酸奶品质明显提高；但当奶粉添加量大于12%时，奶粉添加量对酸奶的品质影响不显著，感官评分差值不大，因此以12%奶粉添加量为最佳值。
2.1.3 白糖添加量的确定
图3可以看出，白糖添加量对酸奶品质的影响极为明显。感官评分随白糖添加量的添加呈现先升后降的趋势，白糖添加量为7%时，感官评分最高；当糖添加量增至9%时，酸奶口感过甜；添加量为13%时，酸奶凝乳不均匀、稠厚感差、甜度无法适口。因此7%的糖添加量最为合适。
图2 脱脂奶粉添加量对酸奶品质的影响
图3 白糖添加量对酸奶品质的影响
2.1.4 发酵温度的确定
由图4可以看出，发酵温度对酸奶品质的影响较大，高于43℃时，酸奶品质剧急下降；发酵温度42℃时，酸奶口感和组织机构最佳，评分85最高；发酵温度43℃时，酸奶口感润滑度下降，发酵温度44℃时，酸奶则产生大量乳清，凝乳不均匀，酸奶原有香味改变。因此选择42℃为最佳发酵温度。
图4 发酵温度对酸奶品质的影响
2.1.5 菌粉添加量的确定
由图5可以看出，当菌粉与奶果混合液1∶1000（质量浓度比）混合发酵时，酸奶凝乳最好，感官评分为86分；而在菌种添加量递减过程中，酸奶品质随之下降；当添加量为菌粉∶混合液=1∶2500时，酸奶凝乳不均匀，香味不明显，口感稀薄，综合品质最差。因而可得，菌粉最佳添加量为1∶1000。
2.2 Plackett-Burman实验设计
表4和表5为PB实验设计及结果分析。由表5可以看出，PB实验的模型P值为0.0004（小于0.01），达到极显著，该模型具有统计学意义。从各因素的P值可知，各因素对酸奶品质的影响力从高到低为果汁添加量＞白糖添加量＞发酵温度＞奶粉添加量＞菌粉添加量，其中果汁添加量、白糖添加量、发酵温度达极显著水平（P＜0.01）。从系数估值可知，白糖添加量和发酵温度对酸奶品质呈正效应影响，其余因素为负效应影响。选择Box-Behnken试验时至少需要3个因素，因此，结合各因素的P值大小，选择果汁添加量、白糖添加量和发酵温度这3个因素进行最陡爬坡实验。
图5 菌粉添加量对酸奶品质的影响
表4 Plackett-Burman实验设计
表5 Plackett-Burman实验结果分析
2.3 最陡爬坡实验
从PB实验结果可知，白糖添加量和发酵温度为正效应，果汁添加量为负效应，则适当提高白糖添加量和发酵温度，减小果汁添加量有利于提高酸奶品质。最陡爬坡试验是根据因素的正负效应及实际情况，确定爬坡方向和合理的步长，以达到快速逼近最佳区域的目的。由表6可知，最佳的组合为实验号2，即果汁添加量为5.5%、白糖添加量为7.5%、发酵温度42.5℃，故以实验号2的条件为Box-Behnken实验设计的中心值。
表6 最陡爬坡实验结果
2.4 响应面实验
响应面实验设计与结果如表7所示。
表7 Box-Behnken实验设计与结果
2.4.1 响应面实验方差分析
在PB实验和最陡爬坡实验的基础上，利用Design-Expert.V8.0.6软件进行Box-Behnken实验设计，结果如表7所示；方差分析如表8所示。通过对试验数据进行多元回归拟合，得到响应面回归模拟方程为感官评分=+93.40+0.75A－1.62B+1.88E+0.75AB－1.25AE－1.00BC－1.95A2－3.20B2－3.20E2。由表8可以看出，模型P＜0.0001，达极显著。失拟项P=0.1234＞0.1，不显著，表明模型对本试验的拟合度良好。回归系数R2=0.9758，模型拟合度良好，R2Adj=0.9448，说明该模型能解释94.48%响应值的变化，可用于百香果酸奶发酵工艺参数的优化。由各因素的P值可知，交互项AE，BE和一次项A(P＜0.05)影响显著；B，E，A2，B2和E2影响均达极显著(P＜0.01)；结果说明该3个因素对百香果酸奶发酵的影响显著，且存在交互作用。
表8 响应面实验方差分析
2.4.2 响应面分析
从图6的响应面图可知本实验的模型存在最大值，依据模型拟合结果，百香果酸奶发酵的最佳工艺为：果汁添加量5.51%，白糖添加量7.35%，发酵温度42.67℃，百香果酸奶的感官评分预测值为93.9705。为便于操作，修订发酵工艺参数为：果汁添加量5.5%，白糖添加量7.4%，发酵温度42.7℃。在此条件下，百香果酸奶的感官评分达到94.33分，与预测值接近。
图6的等高线图可直观地反映出2个变量对百香果酸奶品质的影响显著程度，三个等高线图显示这三个因素两两均存在着交互作用，且交互作用显著。
2.5 酸奶成品质量检测结果
2.5.1 感观评价
按照响应面法得出最佳的发酵工艺，发酵得出百香果酸奶色泽均匀，为浅黄色；组织细腻，凝乳均匀，口感润滑，仅有极少量乳清析出，无分层、气泡；乳香和百香果特有香味浓郁，气味清新，且甜度适口，感官评分达94.33。
2.5.2 理化与微生物检测结果
成品酸度为73°T，乳酸菌为5.8×108mL-1，大肠杆菌没有检出。
3 结论
本实验通过单因素实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面优化发酵法确定了百香果酸奶最佳发酵工艺。结果表明：以果汁添加量、白砂糖添加量和发酵温度为自变量，响应面法优化得出百香果酸奶的最佳发酵工艺为白糖添加量7.4%，接种量0.1%，百香果果汁添加量5.5%，发酵温度42.7℃，发酵时间5 h。在此条件下，酸奶感官评分约达到94.33分，与预测值（93.9705分）基本相符，此结果可充分验证该试验模型的可靠性。实验检测出百香果酸奶的酸度为73°T，乳酸菌检测数为5.8×108mL-1，大肠杆菌没有检测出。本实验研制的百香果酸奶的品质完全符合国家发酵乳的标准[15]。
图6 两两因素交互作用对酸奶品质影响的响应面与等高线图
