内蒙古奶豆腐中优良乳酸菌的筛选及发酵性能研究

林丽清，汪欣，夏九学，姜甜，方曙光

（江苏微康生物科技有限公司，苏州 215000）

0 引 言

随着生活水平的提高，人们对酸奶的认知也越来越多，需求量也在日益增加，自然对酸乳的风味也有较高的要求，而酸奶发酵剂作为酸奶制作过程中主要的微生物培养材料，在乳制品发酵过程中有着至关重要的作用，对发酵乳制品风味和质地的形成以及品质具有重要的影响[1]。酸乳发酵主要是乳酸菌主导的过程，传统发酵乳制品较好的保留了乳酸菌的发酵特性与风味，使发酵酸乳的香气与风味更为突出[2]，其中乳酸菌的产酸性能、持水性和蛋白水解能力对酸乳的状态和风味有很大的影响[3-4]。市售乳酸菌常被作为发酵剂用于食品工业中提升酸奶等发酵食品的质地、风味和营养价值[5]。因此，对乳酸菌发酵剂发酵性能的筛选方法和发酵条件的研究成为很多学者的研究热点。

我国是最早利用乳酸菌发酵食品的国家之一，有着丰富的传统发酵食品资源，辽阔地域上各民族都有独特的民族特色传统发酵乳制品，在新疆、内蒙、甘肃等地，长期的游牧生活孕育了很多优质的益生菌[6-7]。如酸马奶、奶豆腐、奶酪、稀奶油、奶疙瘩等，这些乳制品中含有丰富的乳酸菌，自然选择的结果是这些乳酸菌很好地保存了其生物学特性，同时制作方法有着明显的地域性以及户籍性，从而赋予了乳制品浓厚的地域特色和风味，保存了其中有益微生物，尤其是传接了赋予乳制品独特风味的乳酸菌的自然特性。奶豆腐,作为内蒙古传统发酵乳制品之一,具有几千年的食用历史，本文以内蒙古传统乳制品奶豆腐为原料，通过分离、纯化筛选出产酸、产香和产粘性能好的乳酸菌发酵菌种，同时从基因分子水平对菌株进行鉴定，为开发具有自主知识产权和性能优越的直投式酸奶发酵剂提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料仪器

1.1.1 材料

内蒙古锡林格勒盟正蓝旗不同牧民家庭自制发酵奶豆腐样品。

1.1.2 培养基

基础培养基（MRS）：葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵 2.0 g，吐温-80 1.0 mL，乙酸钠 5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL。

分离培养基：MRS基础培养基加上2%质量浓度的碳酸钙，碳酸钙用牛皮纸包裹，单独灭菌，临用时加入。

种子培养基：基础培养基不加琼脂。

1.1.3 试剂与仪器

市售纯牛奶、白砂糖、三氯乙酸、OPA试剂、甲醇、硼酸钠、十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇、亮氨酸、WFZ UV-2000紫外-可见分光光度计、DHG-9053A型电热鼓风干燥箱、SJH-4S型数控精密恒温水浴锅、DG250型厌氧培养箱、CT 14RD型台式高速冷冻离心机、TA-XT2i型质构仪、三氯乙酸、OPA试剂、甲醇、硼酸钠、十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇、亮氨酸、分析天平等。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离

将奶豆腐样品捣碎后稀释，选取10-2～10-54个稀释梯度，吸取1 mL稀释液，加入到灭菌的平板中，倾入20 mL冷却到55℃左右的含2%碳酸钙的MRS培养基，放入厌氧培养箱中，37℃培养72 h[6]。挑选溶钙圈较大的菌落进行连续划线至得到纯化的单菌落，经革兰氏染色镜检，将典型的链球状菌株保藏。

1.2.2 乳酸菌的鉴定

对纯化的菌落提取总DNA，以1492r、27F为引物扩增16SrDNA，将PCR产物纯化后送上海生工生物工程有限公司测序。将测定的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank中已知的16SrDNA序列同源性进行比较，选取属内同源性较高的模式细菌的16 SrDNA序列进行遗传距离计算，并根据遗传距离计算结果用NJ法绘制系统发育树[7]。

1.2.3 酸奶发酵测试

市售纯牛奶中，按比例加入6%的白砂糖，95℃杀菌5 min，冷却到43℃待用。将活化后的菌株按体积分数1%的比例接种于杀菌处理的纯牛奶中，43℃发酵，跟踪酸度变化，当酸度达到70°T，终止发酵，置于4℃冰箱中冷却后熟。酸奶冷藏过夜后取出，待酸奶温度恢复到10～15℃时，选取10名食品专业人员从色泽、滋气味和组织状态等方面进行感官评价[7]。

1.2.4 菌种后酸化能力测定

将发酵至70°T的酸奶分装置于6℃冰箱冷藏，测定第1、5、10、15、20、25 d的酸度,每次实验重复3次，实验结果取平均值。

1.2.5 菌种持水力测定

取10 mL酸奶放入离心管中。离心管质量记为w1，加入酸奶后的质量记为w2，离心速度为6 000 r/min，离心10 min，静置10 min，吸去上清液，此时质量记为w3。持水性计算公式：M=(w3-w1)/(w2-w1)×100%。

1.2.6 蛋白水解能力的测定

通过文献提供的OPA法测定菌种的蛋白水解能力。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌的分离鉴定

将得到的16 SrDNA测序结果提交到NCBI上进行序列比对，选取相似度较高的模式菌株作为对比，用MEGA5.0软件构建系统发育树，进行聚类性分析，得到的系统发育树如下图1所示。由系统发育树可知，所选择的16株链球菌已报道的模式菌Streptococcus thermophilusATCC19258亲缘关系最为接近，在NCBI上比对其相似度均在98%以上，因此可以将筛选的16株菌确定为嗜热链球菌，并依次命名为T1-T16。嗜热链球菌是国家规定的可用于食品的菌种之一，酸奶发酵的主要作用菌，对酸奶发酵周期、酸奶质构和风味起着决定性的作用，筛选优良的嗜热链球菌资源对于开发直投式酸奶发酵剂具有十分重要的意义。

图1 分离得到的细菌的16SrDNA序列的系统发育树

2.2 分离菌发酵性能研究

2.2.1 酸奶发酵测试

较快的产酸速度一般有利于工业化生产，例如，可以缩短生产周期，增加产能，但过快的发酵速度可能会带来乳清析出的不良影响。实验评估了16株筛选的嗜热链球菌发酵酸奶至70°T所需要的时间，同时评价了冷藏后熟后酸奶的口感和风味。如图2所示，不同菌株产酸速度差异明显，发酵速度最快的是T 13，270 min即到达发酵终点，其次是T 5，T6，T9，T 16。但T 13感官评分不高，主要体现在风味欠缺，如表1所示，可能跟黏度有关系，一般来说黏度较高的菌，风味相对较弱，但高黏度的菌种可以减少搅拌型酸奶增稠剂的使用，较好的保留酸奶质构，在实际生产中可以跟产香较好的菌种搭配使用。综合评价T4，T 6，T 8，T 9，T 12，T14，T 16感官评分较高。

图2 不同菌株发酵过程中酸奶酸度变化

表1 乳酸菌的筛选结果

2.2.2 单菌后酸能力分析

由图3可知，随着冷藏时间的延长，这16株菌发酵的酸奶的酸度均呈现出上升趋势，不同菌株的后酸化能力差异也比较明显，其中菌株T13的后酸化最明显，酸度增加了21°T，说明其后酸化能力最强，菌株T 9和T 16冷藏期间酸度变化最小，4℃冷藏20 d后酸度仅增加了9°T，说明后酸化能力弱，符合优良乳酸菌发酵剂具有的特点，其余菌株后酸化能力差异不明显，储藏20天后，酸度一般增加11～15°T。

图3 冷藏过程中酸度变化

2.2.3 单菌株持水性测定

菌株的持水性与发酵乳的品质密切相关，研究表明单菌株的持水性越高，酸乳对水的保持性越高，从而乳清的析出也会大大降低，有利于提高酸乳的品质。由表2可知，菌株T9和T16的持水性较高，这两株菌发酵酸奶后乳清析出极少，T1次之，T8持水性最低，有少量的乳清析出现象，与前面感官评价结果一致，实验表明，其持水性较高，发酵酸奶的的品质也较为稠厚，黏度较高，乳清析出较少，适用于制作高黏稠厚质感的酸乳。

表2 单菌株的持水性

2.2.5 单菌株的蛋白水解能力

蛋白质的水解是产生各种风味物质的主要途径，发酵乳制品蛋白的水解可以增加酸奶的风味和营养价值，但过度的水解也会影响酸奶的质地，因此适度的蛋白水解对改善酸奶风味和质地以及生成活性肽具有重要作用。因此本实验采用OPA法测定菌株的水解蛋白能力，以便进一步筛选出优良的发酵乳菌株。

由表4可以看出，不同的菌株蛋白水解能力差异很大，这可能与菌株本身的酶系有关，其中菌株T13蛋白水解能力最强，发酵结束后亮氨酸含量为559.52 mg/mL，但感官评分不高，可能与蛋白水解过度有关，菌株T 9具有良好的蛋白水解能力，发酵6 h后，亮氨酸含量达到451.59 mg/mL，然后依次是T 16和T7，而T1和T12的蛋白水解能力保持在相对较低的水平，可能与乳酸菌自身代谢有关，利用了部分氨基酸，具体机理还有待探究。

表3 菌株的蛋白水解能力

3 结论

本实验利用内蒙古传统发酵乳制品奶豆腐，通过初筛和复筛，挑选出16株发酵性能良好的嗜热链球菌(T1～T16)，并结合镜检观察、生化试验以及16SrDNA基因序列分析对菌株进行鉴定。结果显示这16株菌发酵酸乳至70°T所需时间为4-8 h，各菌株在产酸、持水性以及蛋白水解能力存在差异。菌株T 9和T16各方面的性能均比较好，具有良好的产酸能力，后酸能力弱，并且持水性和蛋白水解能力均比较好，制备的发酵乳酸奶风味浓郁，口感优越，质地良好，可用于开发具有良好发酵特性的直投式酸奶发酵剂。