马齿苋水提液对DSS诱导结肠炎大鼠的保护作用

卞艺斐,胡士玲,刘 萍,范 开,王帅玉,刘钟杰

（中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193）

马齿苋（Portulaca oleracea.L.）又名马齿菜、蚂蚁菜、长寿菜、五行草等,系马齿苋科马齿苋属植物,是一种药食同源植物,首载于《新修本草》。《本草纲目》记载:“其叶并比如马齿,而性滑利似苋,故名”。马齿苋性寒、味酸、无毒,入心、肝、脾、大肠经,具有清热解毒、散血消肿、凉血止血、止痢、止消渴等功效,可用于治疗热痢脓血、热淋、带下、便血、疮疡肿毒、湿疹等多种疾病[1]。

炎性肠病（IBD）,包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）,是一种慢性、免疫性肠病,以长期性腹泻、血便、反复性发作为主要临床症状[2]。DSS因带有负电荷的硫酸基而对上皮细胞有一定毒性,诱导其糜烂而损害结肠屏障完整性和增加结肠上皮渗透性,破坏肠黏膜屏障,导致肠道细菌入侵,引起炎症反应。DSS诱导性结肠炎发病部位主要在结肠远端,其病理表现符合溃疡性结肠炎的特点,是较理想的研究模型[3]。

由于日粮配比不合理、过量食用高油高热量食物、运动量不足等原因,宠物临床上炎性肠病的发病率日益升高,严重影响宠物及宠物主人的生活质量。目前的治疗方法多依赖于免疫抑制类药物,如糖皮质激素及5-羟基水杨酸（5-ASA）,这些治疗方法存在副作用明显、治愈率低等问题[4]。迫切需要寻找高效、副作用小的抗炎药物治疗炎性肠病。马齿苋常用于治疗热毒血痢,疗效显著,本次试验旨在验证马齿苋水提液对试验性结肠炎的治疗作用,并探究其机理。

1 材料

1.1 实验动物 体重180 g±7 g的雌性 SD大鼠30只,购自北京军事科学院实验动物中心。

1.2 主要试剂 马齿苋:购自北京同仁堂马连洼分店,低分子量硫酸葡聚糖钠（DSS）:美国 Sigma公司;MPO试剂盒:北京华佰泰生物科技公司;TNF-α、IL-1 ELISA试剂盒:美国R&D公司。

1.3 主要仪器 scout SE602F便携式电子天平:美国OHAUS公司;陶瓷全自动保健壶CK-30C:佛山市飞鹿电器有限公司;旋转蒸发仪RE-64A:上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵:上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1 马齿苋水提液制备 电子天平称取100 g马齿苋,加入1 L蒸馏水,充分浸泡30 min后,先大火煮沸,再调至小火,30 min后停火,室温冷却后将药液用16层脱脂细纱布过滤至大烧杯中,然后用双层分析滤纸加压过滤,最后收集药液用旋转蒸发仪减压浓缩至原药生药浓度为1 g/mL。

2.2 动物分组与给药 将30只大鼠随机分为空白对照组、DSS模型组、高浓度药物组、中浓度药物组、低浓度药物组5组,每组6只。空白对照组:大鼠自由饮用蒸馏水,每日蒸馏水灌胃。模型组:大鼠自由饮用5%DSS溶液,每日蒸馏水灌胃。高剂量药物组:大鼠自由饮用5%DSS溶液,每日给予10 g/kg·bw马齿苋。中剂量药物组:大鼠自由饮用5%DSS溶液,每日给予7.5 g/kg·bw马齿苋。低剂量药物组:大鼠自由饮用5%DSS溶液,每日给予5 g/kg·bw马齿苋。

2.3指标检测

2.3.1大鼠结肠炎疾病活动指数（the disease activity index,DAI）评分 参考文献方法[5]进行DAI评分。DAI由体重减失率分数、大便状态和大便隐血分数相加而得。评分标准:体重减失评分:体重无减轻,0分;减轻1% ～5%,1分;减轻5% ～10%,2分;减轻10% ～15%,3分;减轻15%以上,4分。大便状态评分:正常颗粒状,0分;稍松软,1分;中度松软,2分;不成形,3分;水样粪便,4分。粪便隐血评分:隐血阴性,0分;隐血弱阳性,1分;隐血阳性,2分;隐血强阳性,3分;肉眼可见血便,4分。

2.3.2 结肠组织长/重比 各组大鼠处死后,取大鼠整段结肠。生理盐水洗净肠内容物后,吸水纸吸取表面液体,称重并测量长度。

2.3.3 髓过氧化物（MPO）测定 取近段结肠1 cm,迅速放入液氮中冷冻保存。测定时加入9倍于组织重量的PBS制成10%组织匀浆,按照MPO试剂盒说明书进行操作。

2.3.4 组织炎性因子测定 组织匀浆制备方法同2.3.3,TNF-α和IL-1浓度分别按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

2.3.5 统计学处理 数据采用SPSS 17.0软件进行统计,数据均用平均数±标准差表示,组间比较采用t检验。P≤0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 造模后各组动物一般情况 给予DSS饮用3 d,造模组、高、中、低药物组动物均出现稀便、精神沉郁、竖毛等情况。至DSS饮用第5天,造模组大鼠出现血便,体重明显减轻,而各药物组与造模组相比状态有明显改善,精神状态较好,活动灵活。高、中浓度药物组粪便状态与空白对照组相似。

3.2 大鼠DAI评分 如图1所示,造模组均出现比较严重的体重减轻、水样腹泻甚至血便,DAI评分较空白对照组显著升高;饲喂高、中、低剂量马齿苋组均能显著改善大鼠的症状,DAI均显著降低。

3.3 大鼠结肠组织肠长/肠重 如图2所示,造模组肠长/肠重比值与空白对照组相比显著降低,高剂量、中剂量马齿苋组的肠长/肠重比与造模组相比有较显著升高,低剂量马齿苋组与造模组相比没有显著差异。

3.4 大鼠结肠组织MPO活性 DSS造模组结肠组织中MPO活性较正常组显著增加,不同浓度马齿苋水提液均能显著抑制结肠组织MPO活性,中剂量组效果更好。

图1 不同浓度马齿苋对DSS诱导的结肠炎大鼠DAI

图2 不同浓度马齿苋对DSS诱导的的结肠炎大鼠结肠组织肠长/肠重

图3 不同浓度马齿苋对DSS诱导的结肠炎大鼠DAI

3.5 大鼠结肠组织炎性因子 DSS造模组结肠组织中TNF-α和IL-1的表达显著增高,不同浓度马齿苋水提液均能显著抑制结肠组织TNF-α和IL-1分泌。

4 讨论

炎性肠病为肠黏膜免疫保护效应和调节效应失衡所导致的肠黏膜性疾病。中兽医上认为炎症性肠病发生的关键是湿热内蕴,气血壅滞。目前常用的化学诱导动物模型主要有TNBS和DSS诱导的试验性肠炎。本试验中造模组明显出现体重减轻、腹泻、便血的症状,说明DSS造模成功。在试验第3天,药物治疗组与造模组大鼠均出现明显的腹泻反应,DSS饲喂第5天时,造模组大鼠状态持续恶化,治疗组出现好转,而到DSS饲喂第7天,造模组大鼠出现血便、精神萎靡、体重严重减轻等症状,药物治疗组各方面均明显好于造模组,DAI指数显著降低。MPO是嗜中性粒细胞的特征性酶,组织中的MPO活性代表了嗜中性粒细胞的浸润程度,与炎症密切相关[6]。DSS造模组结肠组织中MPO显著增强,而不同浓度药物组均显著抑制MPO活性。结肠组织肠长/肠重比值减小也是结肠炎炎性浸润的一项重要指标[7]。DSS造模组大鼠肠长/肠重比值与空白对照组相比较显著降低,而高剂量、中剂量马齿苋组均有显著升高。说明马齿苋水提液可以显著抑制结肠组织的炎性反应。TNF-α是最主要的内源性促炎介质;IL-1介导局部和全身的炎症反应,TNF-α和IL-1在炎性肠病进程中发挥着重要的作用,抑制TNF-α和IL-1的表达是治疗炎性肠病的一个重要方面[8]。本试验中,造模组肠组织匀浆中TNF-α和IL-1浓度均显著增高5倍以上,马齿苋治疗组的TNF-α和IL-1浓度均有明显降低,说明马齿苋水提液具有抑制试验性结肠炎炎性因子分泌的功效。综上,马齿苋水提液抑制结肠炎性因子分泌和组织炎性反应,对DSS诱导的试验性结肠炎大鼠有明显的保护作用。

图4 不同浓度马齿苋对DSS诱导的结肠炎大鼠结肠组织炎性因子浓度

马齿苋性味酸寒,临床上多用于治疗热毒血痢。体外抗菌试验表明,马齿苋醇提物对多种细菌、真菌有很强的抗菌能力,被誉为“天然抗生素”[9]。马齿苋水提液能有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[10]。马齿苋对病毒诱导的炎性反应内皮细胞损伤也有良好的保护作用[11]。马齿苋含有丰富的有机酸类、黄酮类、萜类及生物碱类物质,其中有机酸中含量最多的ω-3脂肪酸和黄酮类含量最多的槲皮素、山奈酚均被证明有良好的抗炎作用[12]。马齿苋抗炎的有效成分及分子机理有待进一步研究。