用于软骨缺损修复的壳聚糖水凝胶降解性能的表征*

朱飞燕朱天飞梁仟谭回熊建义**

（1.中山大学材料科学与工程学院，广州510275；2.深圳市第二人民医院组织工程重点实验室，广东深圳518035；3.深圳市第二人民医院深圳神经外科学重点实验室转化医学研究院，广东深圳518035）

目前，创伤和关节炎等引起的关节软骨缺损及骨组织损伤患者日益增多，特别是关节炎引起的关节软骨缺损占很大比例[1]。软骨是一种高度分化的结缔组织，由于其无血管和淋巴管，其营养液主要来自滑液和软骨下血管，尤以前者为主要来源，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外环境中，缺乏迁徙能力，自愈能力有限，因此其缺损修复能力非常有限，软骨缺损修复仍然是一个医学难题[2]。

近年来，软骨组织工程的兴起和发展为治疗软骨缺损疾病带来了新的希望[3,4]。软骨组织工程的一大重要因素即支架材料，支架材料必须能够很好的模拟细胞外环境，并且是生物可降解或可吸收的材料。寻找合适的细胞支架材料所面临的最大挑战就是人体组织的复杂性。水凝胶中含有大量的水分，由于其柔软，可以形成三维网络结构，具有很好的生物相容性，是细胞外基质的理想替代材料，并具有生物粘附性以及生物可降解性[1]。水凝胶的溶胀性、响应性、多孔结构利于营养物质的输送以及代谢产物的输出等优良的性质使其成为组织工程支架材料的理想选择[5]。目前文献报道的软骨修复的水凝胶主要有琼脂类[6,7]、海藻酸类[8]、纤维蛋白类[6,9]、聚乙二醇类（poly ethylene glycol,PEG）[10]、透 明质酸 类（hyaluronic acid,HA）[11]以及壳聚糖类[12,13]等。目前，壳聚糖水凝胶用于软骨缺损修复被广受关注，因为壳聚糖具有葡萄糖胺以及N-乙酰氨基葡萄糖的结构，该结构与软骨中的粘多糖成分相似，可以进一步促进软骨缺损的修复[14]。

将水凝胶作为支架材料用于软骨缺损修复的研究很多，但很少关注支架材料的体内外降解。本研究采用羟乙基脱乙酰壳多糖（glycol chitosan,GC）与二醛基聚乙二醇（OHC-PEG-CHO）通过席夫碱反应交联而形成水凝胶。该水凝胶成胶条件温和，成胶时间可控，具有良好的生物相容性，并且具有可注射性，是一种理想的软骨组织工程支架材料。本文以该水凝胶为例研究了水凝胶在体外以及动物皮下的降解情况，为水凝胶作为软骨缺损修复支架材料的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

GC，PEG（分子量2 kDa，由美国 Sigma公司提供）；磷酸缓冲盐（PBS）（由美国Gibco公司提供）；二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide,DCC），4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine,DMAP）（由北京百灵威试剂公司提供）。

1.2 OHC-PEG-CHO 的合成［15，16］

OHC-PEG-CHO的合成过程与文献报道的类似：对甲酰苯甲酸（2.4 g,16 mol），DCC（3.3 g,16 mmol），DMAP（0.366 g,2 mmol）溶于适量的CH2Cl2，混合均匀后转移到250 ml的单口烧瓶中，放置37℃水浴中搅拌，然后加入 PEG（4 g,2 mmol）的 CH2Cl2溶液，共用CH2Cl2200 ml。反应24 h后将反应物过滤,将滤液浓缩后加入异丙醇，70℃溶解后，-20℃冷却重结晶后迅速过滤。将过滤的固体水洗离心（10000 rpm,10 min）4次后冻干，得到产物OHC-PEG-CHO，产率为80%。

1.3 水凝胶的制备

GC与OHC-PEG-CHO均在紫外灯下照射1 h进行灭菌。水凝胶（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）的制备：用PBS配置250 μl GC溶液（4%w/v）与250 μl的OHC-PEG-CHO溶液（4%w/v），混合溶液加入模具中，5 min内形成水凝胶。

水凝胶（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/1 wt%）的制备：将250 μl的GC溶液（4%w/v）与250 μl的OHCPEG-CHO溶液（2%w/v），混合溶液加入模具中，5 min内形成水凝胶。

1.4 水凝胶的体外降解实验

将0.5 ml不同浓度的水凝胶（GC/OHC-PEGCHO：2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%）制备完成后，分别装入25 ml无菌PBS的样品瓶中，样品瓶使用高压蒸汽（121℃,30 min）提前灭菌。将样品瓶置于摇床（25℃,100 rpm）中进行震荡，定期取出水凝胶，测定pH值、重量和体积变化。①pH值的测定：将水凝胶从降解液取出后，用已校准的pH计测定。②重量变化的测定：将水凝胶从降解液中取出放在滤纸上，用滤纸轻轻擦拭，直至滤纸上无明显的水痕后称重。水凝胶的质量即某个时间点水凝胶的重量占初始重量的百分比。每组水凝胶的质量测定为3个样品，每个样品测定3次，取平均值。③体积变化的测定：水凝胶制备的过程使用圆柱形的模具。水凝胶的体积测定是将水凝胶从降解液中取出放在滤纸上，用滤纸轻轻擦拭，直至滤纸上无明显的水痕后，用游标卡尺测出水凝胶的高和直径，从而计算出水凝胶的体积。水凝胶的体积即某个时间点水凝胶的体积占初始体积的百分比。每组水凝胶的体积测定为3个样品，每个样品测定3次，取平均值。

1.5 水凝胶的皮下降解实验

新西兰兔，雄性、8周龄、体重2.5～3.0 kg（由北京华阜康实验动物有限公司提供），在正常条件下饲养，自由进取食物和水。动物的照料及处理均参照深圳市第二人民医院关于实验动物的使用和照料指导规则。新西兰兔使用戊巴比妥钠（3%）腹腔注射麻醉后，剃除背部毛后用碘伏消毒，手术剪剪出长度为10 mm的伤口。在皮肤下埋入0.5 ml的无菌水凝胶（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）。伤口用手术线缝合。定期取出新西兰兔背部水凝胶，10%的福尔马林固定，石蜡包埋，切出4 μm的薄片后HE染色观察。

1.6 统计学方法

采用Origin 9（Origin Lab Lnc,USA）软件对所收集的数据进行统计学分析，获得的数据通过软件求平均值和标准方差。

2 结果

2.1 水凝胶降解过程中pH变化表征

比较不同浓度的水凝胶（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%）在体外降解的降解液的pH值。如图1所示，两种浓度的水凝胶在体外降解的过程中pH基本维持中性，不会产生酸性或碱性的降解产物，这有利于将水凝胶应用于软骨缺损修复。

图1 水凝胶体外降解的pH变化图

2.2 水凝胶降解过程中质量和体积变化表征

如图2和图3所示，水凝胶（GC/OHC-PEGCHO：2 wt%/1 wt%）在6周时全部降解，而水凝胶（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）在8周时质量为初始质量的（44.30±5.51）%，8周时体积为初始体积的（50.64±9.81）%，该降解速度与软骨修复速率一致。

图2 水凝胶体外降解的质量变化图

图3 水凝胶体外降解的体积变化图

因此，水凝胶的降解速率与组分的浓度有关，浓度越大，水凝胶的降解时间越长。可能是随着水凝胶组分浓度的增加，水凝胶的交联度增加，降解时间变长。

2.3 水凝胶降解过程中相容性表征

根据以上测试结果，我们选取水凝胶（GC/OHCPEG-CHO：2 wt%/2 wt%）继续进行体内相容性的测试。动物的皮下植入实验可考察材料在降解过程中产生的炎症反应、过敏反应等，为材料的进一步应用提供基础。水凝胶植入3周后的体积明显减小，同时水凝胶的表面已附上动物的组织（图4）。由此可见，水凝胶在降解的过程中，与动物的相容性很好。将体内取出的水凝胶进行HE染色分析示水凝胶在皮下组织中无明显的炎症反应（图5）。

图4 水凝胶植入前的初始状态（A）和皮下植入3周后取出的状态（B）

图5 水凝胶皮下植入3周后取出的HE染色（A、B）

3 讨论

本研究考察了GC/OHC-PEG-CHO水凝胶的降解性能，降解实验表明其降解速率与分组浓度有关。可通过调节水凝胶成分的浓度来调控水凝胶的降解时间。将水凝胶植入动物皮下的实验表明，水凝胶的相容性较好，与动物组织无明显的炎症反应。因此，GC/OHC-PEG-CHO水凝胶可作为一种优良的软骨组织工程支架材料的选择。后续，仍需将该水凝胶进行软骨修复的性能表征研究，以期为临床的软骨组织工程提供一种理想的支架材料。

综上，降解性能的测试表明水凝胶的降解时间与水凝胶组分的浓度有关，水凝胶的组分浓度越大，水凝胶的降解时间越长。动物的皮下植入测试表明水凝胶植入后，与组织无明显的炎症反应，具有良好的生物相容性。因此，GC/OHC-PEG-CHO水凝胶可作为一种软骨组织工程支架材料的备选。