银杏双黄酮类化合物研究进展

马小芳，杨世龙，唐 颖，周梦怡

(南京林业大学现代分析测试中心，江苏南京 210037)

银杏叶中含有丰富的营养成分，主要含有黄酮类、内酯类、多糖类、儿茶素类、聚异戊烯醇、烷基酚及酚酸类、原花青素类、氨基酸类、维生素、脂肪类、有机酸类和微量元素等200多种化合物。银杏叶提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaf，EGb)是采用一定的工艺将银杏叶中银杏黄酮、银杏内酯等主要活性成分提取出来的产品，具有多种生物活性，应用广泛。由于银杏叶中黄酮类化合物含量较高、活性较好，因此，有关黄酮类化合物的研究方兴未艾。银杏黄酮类包括银杏单黄酮和银杏双黄酮，它们都具有许多生物活性，但由于银杏双黄酮在银杏叶中含量较低，研究较困难，所以研究相对较少，但其应用前景较好。

银杏双黄酮是由两分子黄酮母核通过C－C键聚合而成的一类化合物，主要有6种，分别为穗花杉双黄酮、金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果黄素，5＇－甲氧基白果黄素。主要双黄酮类化合物结构如图1所示。

图1 主要银杏双黄酮结构式Fig.1 The structures of biflavonoids in ginkgo leaves

1 银杏双黄酮类化合物的提取与纯化

早在1929年，Furukawa就从银杏叶中提取分离得到了双黄酮类化合物，但由于科技水平限制，直到1941中泽浩一分离出了银杏黄素，并确定了它的分子式为C32H22O10［1］。到 20 世纪60年代，随着现代分离分析技术的发展，使人们对银杏叶的基本成分有了新的更深入的认识。BarKer等人［2］又用萃取、重结晶、逆流分离等方法，从银杏黄素的混合物内分离出异银杏黄素和白果黄素两种双黄酮。1969年 Miura等人［3］从银杏叶中首次分离得到金松双黄酮，1980年，Marc等人［4］从银杏叶中首次提取得到了5＇－甲氧基白果黄素，1988年，Lobstein等人［5］首次在银杏叶中得到了穗花杉双黄酮，1999年，Krauze等人［6］从银杏叶中分离得到了2，3－二氢金松双黄酮，2005年，Hyun等人［7］还从银杏叶中提取得到了银杏黄素和异银杏黄素的糖苷。我国对银杏叶中双黄酮的研究较晚，1983年，周日秀［8］对庐山银杏叶中的双黄酮进行分离鉴定，得到金松双黄酮和异银杏双黄酮。1991年，游松等［9］对银杏叶中的双黄酮进行了结构分析;1995年钟郁青等［10］分离得到银杏黄素、异银杏黄素和去甲基银杏黄素，并采用内标法测定其含量;1999年，王晓葵［11］发现用乙二醇二甲醚提取银杏叶，提取液中的双黄酮含量较高，效果比乙醇、甲醇和乙醇－乙醚(1∶1)好，而用乙醇－乙二醇二甲醚(1∶1)混合提取银杏叶，提取液中双黄酮含量更高，所得提取物中银杏双黄酮的含量达53.89%;2001年唐于平等［12］从银杏叶中分离得到银杏黄素、异银杏黄素和金松双黄酮;2006年尉小慧等［13］从银杏叶中分离得到了银杏黄素、去甲基银杏黄素和金松双黄酮，并研究了其对磷酸二酯酶5抑制活活性;2010年，孔繁晟等［14］从银杏叶中制备的金松双黄酮可以作为对照品，得到纯度为98.5%金松双黄酮。2012年姚鑫等［15］分析了银杏落叶的化学成分，经提取、萃取、过柱得到银杏黄素、异银杏黄素、金松双黄酮和白果黄素。

提取银杏叶中双黄酮的主要方法是溶剂回流法，所得提取液中往往成分复杂，含有单黄酮、黄酮苷、糖类、鞣质、酸类等多种成分，需要进一步分离纯化，需经萃取、过柱、重结晶等分离纯化方法得到不同双黄酮的单体。

1.1 提取溶剂的选择

与单黄酮和黄酮苷相比，双黄酮类化合物极性较小，采用极性相对较小的溶剂可以提高双黄酮的提取率。目前常用于提取双黄酮的溶剂有95%乙醇、乙醇、甲醇、60%丙酮、丙酮、乙醚、氯仿、乙醇－乙二醇二甲醚(1:1)混合溶剂等。采用加热、超声、微波等辅助方法，以此来提高双黄酮的提取率;采用索式提取等方法可以减少后处理操作，提高效率。

1.2 分离纯化

常用来分离纯化双黄酮类化合物的方法有萃取、柱色谱、重结晶等方法，随着科技的发展，高效逆流分配色谱、制备液相等仪器的出现大大提高了分离效果和工作效率。根据相似相容原理，双黄酮类化合物易溶于极性较低的化合物，如乙酸乙酯、氯仿等;同时，双黄酮类含有酚羟基，也易溶于碱性水溶液中，因此，可以采用不同极性的有机溶剂、不同pH的碱性溶液作为萃取剂、洗脱剂或重结晶溶剂，将不同种类的化合物分离，从而得到双黄酮类化合物。例如，Miura等人［3］将银杏叶的甲醇提取液旋干，得到甲醇粗体物，先用热水除去粗体物中水溶性成分，剩下的粗提物用三氯乙烯回流，收集不溶固体，用3%KOH溶液溶解，过滤，酸化，得到的沉淀用50%乙醇溶解，将不容固体乙酰化，再用乙酸乙酯重结晶，得到的晶体用2.5%KOH水解，吡啶－甲醇重结晶，得到双黄酮混合物，采用逆流分配法得到白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素和金松双黄酮。

由上可以看出，银杏叶中双黄酮的提取步骤较为繁琐，但基本操作包括:先采用醇、酮、乙醚等提取，将提取液用碱性水溶液或有机溶剂萃取，将乙酸乙酯或氯仿萃取部分上硅胶柱，采用不同极性的溶剂洗脱，得到双黄酮粗体物，经重结晶得到双黄酮化合物单体。

2 银杏双黄酮类化合物的生物活性

双黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。

2.1 抗肿瘤活性

Pan等［16］从分子结构上研究了穗花杉类双黄酮与组织蛋白酶B相互作用，进一步揭示了双黄酮抑制组织蛋白酶B的机理，有利于进一步了解双黄酮抗炎、抗肿瘤的机理。研究研究发现银杏黄素具有抑制卵巢癌的作用，其IC50值为1.8μg·mL－1。穗花杉双黄酮通过激活hPPARγ来提高抗癌基因的表达，从而达到抑制乳腺癌细胞和宫颈癌细胞的效果［17－18］。Sang等［19］研究发现异银杏黄素通过抑制HT1080纤维肉瘤细胞中的MMP－9表达来抑制癌细胞的增殖。

2.2 抗氧化活性

潘苏华等［20］研究发现异银杏双黄酮使缺氧大鼠血浆及红细胞内超氧阴离子含量降低，其作用优于阿司匹林;此外异银杏双黄酮能使血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性升高。Lee等［21］研究发现，穗花杉双黄酮可以抑制由紫外辐射引起的金属蛋白酶的表达，从而起到抗氧化、防辐射的作用。Zhang等［22］研究发现穗花杉双黄酮和银杏黄素具有一定的抗氧化活性，去除DPPH自由基的能力较强。Li等研究表明［23］，穗花杉双黄酮具有抗氧化活性，可有效清除·OH，·O2－，DPPH·，ABTS+·等自由基，并可以保护DNA免受·OH引起的氧化损伤。

2.3 抗炎活性

银杏双黄酮类化合物通过抑制磷脂酶A2、促炎基因的表达起到抗炎的作用。Hyun等［24］通过对小鼠模型研究发现银杏黄素能抑制慢性皮炎，还能抑制表皮增生。Son等［25］研究发现，银杏黄素通过抑制小鼠骨髓中的环氧合酶－2和5－脂氧合酶来达到治疗关节炎的效果，其IC50值为分别为0.75μmol·L－1和 0.33μmol·L－1，同时，银杏黄素还能抑制细胞脱粒反应，其IC50值为6.52μmol·L－1。Zhou 等［26］采用 SEAP 实验法得到银杏黄素和异银杏黄素能抑制NF－κB因子，从而起到抗炎的作用，且银杏黄素的抑制作用强于异银杏黄素，其IC50值为7.5 μmol·L－1。An等［27］的研究表明，穗花杉双黄酮具有较好的抗炎效果，可以有效抑制因牛皮癣引起的皮肤褶皱增厚和红疹，其机理是穗花杉双黄酮通过影响一系列激素而起到抗炎的作用，可以作为治疗牛皮癣的药物。

2.4 抗病毒活性

Lin等［28］体外研究表明穗花杉双黄酮可以抑制HIV－1病毒，IC50值为119μmol·L－1。Wilsky 等［29］研究表明，穗花杉双黄酮通过抑制脂肪酸合酶来降低柯萨奇病毒B3的增殖。Ryu等［30］研究发现穗花杉双黄酮具有较强抑制SARS－CoV3CLpro病毒活性，IC50 值为 8.3μmol·L－1。

2.5 灭菌杀虫活性

Hwang等［31］研究发现穗花杉双黄酮能引起白色念珠菌线粒体紊乱，引起细胞凋亡，达到抑菌的效果。Weniger等人［32］研究发现银杏黄素和异银杏黄素具有杀灭锥体虫的活性，IC50值分别为11，13μmol·L－1，此外异银杏黄素对杀灭利什曼原虫具有较高的活性，其 IC50值为 1.9μmol·L－1。

2.6 生理调节作用

Saponara等［33］研究发现，双黄酮类化合物可以抑制cAMP－磷酸二酯酶，其抑制顺序为:穗花杉双黄酮＞白果黄素＞红杉黄酮＞银杏黄素=异银杏黄素，而金松双黄酮几乎没有抑制作用。von Moltke等［34］的研究结果表明，穗花杉双黄酮可有效抑制细胞色素 P450家族中的 CYP2C9，IC50值为0.019μg·mL－1(0.035 μmol·L－1)。Lee等［35］研究发现穗花杉双黄酮是过氧化物酶体增殖剂激活受(hPPARγ)激活剂，可以通过调节hPPARγ来调节生物体的新陈代谢，并研究了穗花杉双黄酮和hPPARγ的结合模型。

2.7 抑制心脑血管疾病

双黄酮化合物具有调节血糖血脂，防止血栓形成的作用，对中风老年痴呆有一定活性。潘苏华等［36］研究证明，异银杏双黄酮体内给药，可以抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板聚集，血浆纤维蛋白原含量明显降低。体外实验表明，异银杏双黄酮对ADP和胶原诱导的血小板聚集均有抑制作用，也能抑制胶原诱导的血小板变形和减慢血小板最大聚集速度，因此异银杏双黄酮具有抑制血小板聚集、防止血栓形成的作用。Arjun Thapa等［37］研究表明穗花杉双黄酮可以阻止β－淀粉状蛋白聚合，防止老年痴呆症的发生，且双黄酮类化合物的活性强于单黄酮。

2.8 其他作用

此外双黄酮化合物还具有保护神经系统、促进骨骼发育等作用。Kang等［38］研究发现穗花杉双黄酮、银杏黄素和异银杏黄素对氧化和β－淀粉状蛋白引起的神经细胞损伤具有较强的抑制作用，起到保护神经系统的作用，具有治疗中风、老年痴呆等神经疾病的潜力。Ishola等［39］研究表明穗花杉双黄酮具有抗抑郁、抗焦虑的作用，可改善小鼠的精神状态。Lee等［40］通过研究小鼠骨细胞中碱性磷酸酶活性、胶原合成和矿化程度发现白果黄素和金松双黄酮具有促进骨细胞分化的作用，有望应用于治疗相关骨骼疾病。Prasad等［41］发现穗花杉双黄酮具有在体内降低油脂的活性，有望用来治疗高血脂等由脂肪过多引起的疾病。

3 展望

银杏双黄酮类化合物具有多种生物活性，且部分生物活性强于单黄酮，是一类具有开发应用前景的化合物。双黄酮类化合物在天然产物中来源少，开展双黄酮类化合物的全合成工作很有意义;此外可以对天然双黄酮类化合物进行改性，以提高其生物活性，更好的应用于医疗保健。研究银杏双黄酮不仅进一步利用银杏叶资源，更可以造福于人类。