2 466例高危型人乳头瘤病毒亚型的感染和分布研究

杨紫汐，龙文波，陈 明，刘 云，刘 洁，张原雪，孙兴旺△

(1.西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000；2.西南医科大学临床医学院病理教研室，四川泸州 646000)

人乳头瘤病毒(HPV)分为低危型(LR-HPV)和高危型(HR-HPV)两类，前者主要引起低级别上皮内病变，后者不仅能引起高级别病变，同时有导致癌变的风险[1-2]。HR-HPV具有基因型的差异，在致癌能力和致病形式上存在许多区别[3]。研究HR-HPV基因型的分布特点，有助于优化利用地区医疗资源，开发更经济高效的防治手段。

本研究采用2 466例女性宫颈脱落细胞DNA样本，采用荧光定量PCR技术对13种HR-HPV基因型进行检测，并研究HPV的病毒载量与上皮内病变程度的相关性，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 样本来源为2014-2017年在西南医科大学附属医院就诊的女性患者。从样本库中总计获得2 466个患者宫颈脱落细胞的DNA样本。患者年龄16～77岁，平均(39.7±9.4)岁，均先进行液基细胞学检查(TCT)。组织病理学检查确定有病变或可疑样本的病变情况(合计1 469例)。本研究的体外试验程序通过西南医科大学附属医院伦理审查委员会审核批准，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量PCR检测 脱落细胞悬液样本试管加入1.0 mL无菌水，震荡混匀，吸取适量液体转移至1.5 mL离心管，之后离心收集细胞和组织。DNA提取和定量PCR检测13种HR-HPV基因型(HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68)按照上海之江生物科技股份有限公司的HR-HPV分型核酸测定试剂盒方法进行。定量PCR检测的内参基因为人类基因组进化上保守的双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶a(DYRK1a)。

1.2.2 宫颈病变诊断 TCT细胞学检查按照2001年国际病理学会修订的TBS系统诊断标准进行：未见上皮内病变或恶性细胞(NILM)，包括正常和炎症组织；能明确意义的非典型鳞状上皮细胞/含不能排除高级别病变(ASC-US/H)；低级别鳞状上皮病变(LSIL)；高级别鳞状上皮病变(HSIL)；鳞状细胞癌(SCC)；不典型腺细胞(AGO)和宫颈腺癌(ECA)。对检测到上皮内病变或恶性细胞的病例进行的病理学检查，按照2014年WHO(第4版)标准分类：(1)炎症和良性病变：包括宫颈炎、宫颈纳氏囊肿、宫颈肥大、触血、糜烂、尖锐湿疚、息肉等；(2)宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ：轻度CIN，相当于LSIL；(3)CINⅡ和CINⅢ：分别为中度和重度CIN，相当于HSIL，其中CINⅢ包含原位癌；(4)宫颈癌：浸润性宫颈癌；(5)其他为术后复查病例等。

1.2.3 相关性分析赋值 相关性分析中定义上皮内病变CINⅠ至CINⅢ按恶性程度分别对应分值为1～3分，宫颈癌对应分值为4分，正常宫颈、炎症和良性病变及其他组对应分值为0分。HPV病毒的DNA载量计算公式：DNA载量=2内参CT值-HPV扩增CT值，CT值即PCR扩增的循环阈值。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0软件处理统计结果，计数资料用率表示，组间采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈病变分布 细胞学检查为LSIL的样本97个，经组织病理学诊断为CINⅠ的有70个(72.16%)；细胞学检查为HSIL的样本136个，经组织病理学诊断为CINⅡ～Ⅲ的有112个(82.35%)；细胞学查见癌细胞的样本37个，经组织病理学诊断为浸润性宫颈癌的有30个，符合率81.08%；细胞学检查为ASC-US/H的样本38个，经组织病理学诊断符合良性和炎症病变的21个(55.26%)，符合CINⅠ的有16个(42.11%)，符合CINⅡ～Ⅲ的1个(2.63%)。组织病理学检查发现存在炎症、良性病变和恶性病变的样本合计1 469个，其分布为：炎症和良性病变(1 064/1 469，72.43%)，CINⅠ(99/1 469，6.74%)，CINⅡ～Ⅲ(132/1 469，8.99%)，宫颈癌(33/1 469，2.25%)及其他(141/1 469，9.60%)，见表1。在>30～40年龄组中，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌患者的分布比较差异无统计学意义(P=0.074)，但是CINⅠ和CINⅡ～Ⅲ的比例随着年龄增长有所增加(P<0.05)。宫颈癌的病例超过80%出现在大于40年龄组中，且随年龄增大比例增加，见表2。

表1 2 466例样本的HPV感染情况

2.2 HR-HPV基因型的分布 在2 466个样本中，总计检测到575个(23.32%)HR-HPV感染样本，其中468个(81.39%)为单基因型感染，90个(15.65%)为双基因感染，14个(2.43%)为3基因型感染，还有3个(0.52%)为4基因型感染(表3)。在50岁以下的患者中，HR-HPV的感染率接近，在16～30、>30～40和>40～50组中分别为23.19%(109/470)、23.66%(176/744)和21.38%(217/1 015)。但在大于50岁患者中，HR-HPV的感染率明显提高，在>50～60和>60组中分别达到29.63%(56/189)和35.42%(17/48)。

表2 不同年龄段患者宫颈的上皮内病变情况[n(%)]

表3 HPV感染的基因型数目分布情况[n(%)]

HPV不同基因型中，感染频率最高的是HPV-52，总共在154个(26.78%)HR-HPV感染样本中检测到，其余基因型依次为HPV-16(24.87%)、HPV-58(20.52%)、HPV-51(9.22%)、HPV-39(8.35%)、HPV-33(5.74%)、HPV-56(5.57%)、HPV-35(4.70%)、HPV-31(4.00%)、HPV-18(4.00%)、HPV-59(3.83%)、HPV-68(2.96%)和HPV-45(1.57%)。HPV-52、HPV-16和HPV-58是HPV感染的主要类型，三者在HR-HPV感染样本中所占比例合计达72.17%。但是，尽管HPV-52总感染率最高，在CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌样本中，HPV-16(25.00%、57.58%)和HPV-58(16.67%、12.12%)的比例却超过HPV-52(11.36%、3.03%)。此外，HPV-33在CINⅡ～Ⅲ样本中也有较高比例(11.36%)。除HPV-52、HPV-16和HPV-58外，HPV-51、HPV-39、HPV-33和HPV-56的在HR-HPV感染样本中的比例均超过5.00%，合计共28.88%。各基因型在不同病症的分布见图1。

图1 2 466个样本的HPV基因型按照病症表现分布

HPV基因型与年龄的相关关系相关系数P与宫颈上皮病变程度的相关关系相关系数P160.1560.0670.2030.015180.4440.0390.1970.38031-0.0540.8050.0610.782330.1060.5580.1150.523350.0600.771-0.2040.31939-0.0010.993-0.1040.48645-0.4770.232-0.1900.624510.1040.4610.0450.74752-0.2100.802-0.1900.81556-0.0060.9760.0990.60258-0.1830.0510.3090.00159-0.0470.846-0.0750.75568-0.4460.110-0.1980.498合计-0.0090.8120.209<0.01

2.3 HPV的DNA载量与上皮内病变程度的相关性分析 HPV病毒的DNA载量与上皮内病变程度呈正相关(P<0.01)，而与患者年龄没有明显相关性(P=0.812)。HPV-16和HPV-58的DNA载量与上皮内病变程度呈明显正相关(P<0.05)，HPV-18与年龄呈正相关(P=0.039)，见表4。

3 讨 论

HPV感染是宫颈癌的关键诱发因素。本研究分析了川南地区HR-HPV感染的分布特点，发现2 246例患者样本中HR-HPV的总感染率为23.32%，接近中国地区大样本研究结果[4]。其中宫颈癌样本HR-HPV的检出率为81.82%，符合其他不同地区研究报道的80%～96%的感染率[1,5]。

世界范围内HR-HPV基因型的分布具有地域特点，但在总体上以HPV-16和HPV-18感染率最高[1,5]。而本研究感染率最高的5个基因型为HPV-52、HPV-16、HPV-58、HPV-51和HPV-39，而HPV-18较低。这可能是因为HPV-18主要出现在腺癌[6]，本地区的宫颈癌样本基本都是鳞癌所致。HPV-52和HPV-58的感染率极高，在2 466个样本中分别占第1和第3位，表明在亚洲东部这两种基因型可能具有很强的导致上皮病变能力[7-9]。然而，在CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌样本中，HPV-16的感染率最高远超过其他基因型，表明HPV-16是最能引起恶性上皮内瘤变的基因类别[10]。值得注意的是，HPV-58在CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌样本中的感染率仅次于HPV-16，提示在川南地区HPV-58可能是也是极具危害性的基因类型。

目前学界已经知道，HPV的持续感染是宫颈癌发生的主要因素之一。HPV感染常无临床症状，感染平均持续时间8～12个月，高危型的平均清除时间为8～14个月，但是HPV-16和HPV-18持续感染的时间更长[11]。2015年美国阴道镜和宫颈病理学会和妇科肿瘤协会临床指导指出：如果HPV-16和HPV-18阳性，无论TCT结果如何都建议进行阴道镜检查；如果其他HR-HPV阳性，细胞学无异常，建议1年内随访[12]。本研究提示HPV-58在川南地区具有极强的致高级别上皮内瘤变和宫颈癌能力，危害性仅次于HPV-16，高于本研究其余的HR-HPV基因型。因此，对川南地区的HPV-58阳性患者，即使其细胞学无异常，可能也有必要进一步进行组织学检查或进行更密切的临床随访。

目前研究表明，HR-HPV病毒的DNA载量与宫颈病变存在明显正相关关系，可能作为预测宫颈病变程度的生物学标记[13-15]。本研究发现HPV病毒的DNA载量与上皮内病变程度呈明显正相关(P<0.01)，与该观点一致。大量的病毒DNA感染导致机体清除机制更难发挥作用，因而长期持续感染某一亚型更容易导致宫颈癌发生[16-18]。然而，本研究HR-HPV的13种基因型中，仅有HPV-16和HPV-58的DNA载量与上皮内病变程度呈明显正相关，其余基因型均无明显相关性。提示HPV-16和HPV-58型致宫颈上皮病变可能具有不同于其余亚型的作用机制，其DNA载量有可能作为检测的生物学标记，但这一点还需更多研究加以证明。