利用β-环状糊精脱除大米蛋白肽苦味研究

2018-12-28胡炜张吉刘鑫谭春明孙通

质量安全与检验检测 2018年6期

胡炜张吉刘鑫谭春明孙通

1.青岛出入境检验检疫局山东青岛 266001；2.黄岛出入境检验检疫局；3.中国海洋大学

我国是全球稻米的种植大国，2014年我国稻米产量2.06亿吨，占全世界的41.7%，稻米资源丰富。大米蛋白不仅具有合理的氨基酸配比、低致敏性、与动物蛋白相媲美的生物价与蛋白质效用比等营养价值，还有抗癌变等保健功能。大米蛋白的深度开发与利用日益受到重视[1-5]。

具有激素调节、免疫系统调节、抗氧化等功能的生物活性肽是大米蛋白深加工的重要产品，抗氧化肽作为其中一种，具有很强的功能性与很高的安全性。酶解法生产条件温和，水解比较容易控制，可以生产特定的产品，且成本相对低廉，是目前生产活性肽的首选[6]。通过酶解法制备大米蛋白抗氧化肽可以很好地延伸大米加工产业链。

在本文的前期研究中，以大米蛋白粉为反应底物，选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶3种蛋白酶为工具酶，以酶解液对DPPH自由基的清除率及水解度为指标，选取酶解pH、酶解温度、加酶量、底物浓度分别做单因素实验，分析实验数据确定最佳用酶，而后采用Box-Behnken响应面设计法优化得到了最佳酶解工艺。

蛋白质酶解后会产生一些含有疏水性氨基酸残基的肽类，从而导致不同苦味的产生。为了获得营养与口感风味俱佳的肽类产品，人们目前常运用选择性分离、包埋掩盖法、酶法、微生物发酵法等技术降低肽类的苦味。相比于选择性分离、酶法等技术，包埋掩盖法既不会影响肽类的功能性，还可以通过包埋剂将苦味氨基酸进行包埋达到脱苦的功效，常用的包埋剂有谷氨酸钠、明胶、甘氨酸、环状糊精等。β-环状糊精是一种具有像酶一样的疏水结合部分的低聚糖，结构稳定，且其无毒、低成本的特性促使他成为一种优良的包埋剂。

本文使用β-环状糊精对大米蛋白抗氧化肽进行脱苦实验，根据β-环状糊精添加量、温度、pH 和时间的单因素实验结果，采用正交实验进一步优化，通过脱苦效果得分（百分制），确定β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件。

1 实验材料与设备

1.1 材料

大米蛋白（食品级）：湖南润涛生物科技股份有限公司（含蛋白质≥80%，纤维素≤6%，碳水化合物≤10%，脂肪≤2%，灰分≤2%）；

木瓜蛋白酶：南宁东恒华道生物科技公司；

β-环状糊精：孟州市华兴生物化工责任有限公司。

1.2 设备

水浴锅；喷雾干燥器；离心机。

2 实验方法

2.1 大米蛋白抗氧化肽的制备

称取一定量大米蛋白，与一定量蒸馏水配置成底物质量浓度为5 g/100 mL的蛋白液，调节pH值为5.25，按加酶量5.6 U/mL加入木瓜蛋白酶，置于恒温水浴锅中61.4℃温度下酶解1 h，结束后于沸水浴中灭酶10 min，然后在3 500 r/min下离心10 min，取上清液进行喷雾干燥，得肽粉。

2.2 苦味的评价方法

感官评价和仪器评价是评价蛋白质水解产物苦味的两种主要方法。但这两种方法均有不足，感官评价虽然简单但是容易因主观因素而产生较大的差异；仪器评价法是未来的发展趋势，但却受到技术限制，蛋白质水解产物的苦味强弱亟需新型的方法来评价。目前仍然是以感官分析方法作为主要的苦味评价方法，仪器分析作为辅助评价方法。在此选用感官评价分析方法对苦味进行评定。

2.3 苦味评价标准的确定

人为地将大米蛋白抗氧化肽的浓度分为10个等级，分别对应10个分值，将大米蛋白抗氧化肽浓度为10.0%的苦味值规定为10，依此类推，共10个标准苦味值，详见表1。取待评液2～3 mL放入口中充分品尝，之后与标准苦味值溶液进行对比，反复尝试直到确定其苦味值为止。最后的苦味值取自5人以上的平均值。

表1 苦味评价标准

2.4 β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的单因素实验

2.4.1 β-环状糊精添加量对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

取5只50 mL烧杯，每只烧杯中放入准确称取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g，分别加入9.0 mL蒸馏水，pH调节为6.0，分别加入β-环状糊精0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g，然后放在40℃的水浴锅当中恒温反应60 min，按照表1苦味评价标准，研究β-环状糊精添加量对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响。

2.4.2 温度对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

取5只50 mL烧杯，每只烧杯中放入准确称取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和最适β-环状糊精添加量0.3 g，分别加入9.0 mL蒸馏水，pH调节为6.0，在温度分别为 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的水浴锅中恒温反应60 min，按照表1苦味评价标准，研究温度对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响。

2.4.3 pH对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

取5只50 mL烧杯，每只烧杯中放入准确称取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和β-环状糊精0.3 g，分别加入9.0 mL蒸馏水，pH分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在40℃的水浴锅中恒温反应60 min，按照表1苦味评价标准，研究pH对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响。

2.4.4 时间对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

取5只50 mL烧杯，每只烧杯中放入准确称取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和β-环状糊精0.3 g，分别加入9.0 mL蒸馏水，pH调节为6.0，然后在40℃的水浴锅中分别恒温反应10 min、30 min、60 min、90 min、120 min，按照表1苦味评价标准，研究时间对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响。

2.4.5 β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的最优条件确定

在大米蛋白抗氧化肽脱苦的单因素实验的基础上，以β-环状糊精添加量、温度、pH和时间为四因素，设计正交实验表，通过脱苦效果得分（百分制），确定β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工艺。

3 实验结果及分析

3.1 β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的单因素实验结果

3.1.1 β-环状糊精添加量对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

由图1可知，在β-环状糊精添加量为0.1～0.3 g的范围内，大米蛋白抗氧化肽的苦味值随着β-环状糊精的加入量增加而开始降低，当加入量为0.3 g时苦味值出现最低；而继续增加时苦味值反而上升。分析β-环状糊精加入一定量后会产生焦糊味，另外，焦糊味随加入量的增加而加重。因此选取0．25～0．35 g作为β-环状糊精较适宜的添加量范围开展后续实验。

图1 β-环状糊精添加量对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

3.1.2 温度对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

由图2可知，刚开始随着温度的上升大米蛋白抗氧化肽的苦味值逐渐降低，当温度为40℃时苦味值降为最低，40℃之后随着温度的升高苦味值反而上升。这可能跟β-环状糊精吸收的能量有关，β-环状糊精加入量过多时吸收能量也会过多，从而导致其分子的空间结构发生改变，而使其包埋能力降低。因此选取30～50℃作为β-环状糊精较适宜的反应温度范围开展后续实验。

图2 温度对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

3.1.3 pH值对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

由图3可知，大米蛋白抗氧化肽的苦味值在pH 4到6范围内，随着pH的升高而降低，并在pH为6．0时苦味呈现最低值，但是，当pH＞6．0时，苦味值反而回升，且具有随着pH的升高而上升的趋势。这可能是β-环状糊精的微结构受pH值影响，分子的空间结构发生改变，降低了脱苦的效率和选择性，从而影响其包埋能力。因此选取 pH 值 5．5～6．5作为 β-环状糊精较适宜的反应pH范围开展后续实验。

图3 pH值对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

3.1.4 时间对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

由图4可知，大米蛋白抗氧化肽的苦味值并没有随脱苦的时间而发生太明显变化，尤其是在60～100 min之内，几乎不变，而之后随着脱苦时间的继续增加，苦味值出现了一定的增加，这可能是脱苦时间过久导致β-环状糊精分子的微结构发生变化，从而影响其脱苦能力。因此选取50～70 min作为β-环状糊精较适宜的反应时间范围开展后续实验。

图4时间对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响

3.2 β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽最优条件的确定

3.2.1 正交实验因素水平设计

根据因素β-环状糊精对大米蛋白抗氧化肽脱苦的单因素实验结果，以β-环状糊精添加量、温度、pH值、时间对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果的影响，设计四因素三水平，按照表2所示L9（34）正交实验表进行实验，确定β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工艺。

表2 β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽L9（34）正交实验因素水平表

3.2.2 实验结果及分析

通过正交实验，由10位食品专业的学生（5男5女）对产品进行感官评价，得出综合平均感官得分（为方便计算，在表1设计的基础上，扩展为百分制，即将大米蛋白抗氧化肽浓度为10.0%的苦味值规定为100，依此类推，共10个标准苦味值），结果如表3所示。通过极差分析，得出各因素对实验结果的影响大小顺序为C→D→B→A，即对大米蛋白抗氧化肽脱苦效果影响最大的因素是pH值，其次是时间，再次是温度，β-环状糊精添加量影响最小；此外，分析可知β-环状糊精脱苦大米蛋白抗氧化肽的最优配方因素组合为A2B1C2D3，即当β-环状糊精添加量为0.30 g每克大米蛋白抗氧化肽，温度控制在30℃，pH 6.0，恒温 70 min，实验效果最佳。