甘肃省武威市苜蓿镰孢根腐病菌的鉴定

张贞明，柏玉晶，阿不满，杨成德

(1.甘肃草原技术推广总站，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070; 3.甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

苜蓿(Medicagosativa)抗逆性强，蛋白含量高，有“牧草之王”的称号，具有固氮能力，且根系发达，可有效防止表层土壤侵蚀，是保持水土和改土培肥的重要生态植物[1]；在我国种植面积约3.77×106hm2，居各类人工种草之首[2]，主要分布在内蒙古高原、东北地区、黄土高原、新疆维吾尔自治区、黄淮海地区等[3]。但是，随着苜蓿种植时间的增长，根腐病发生日趋严重[4-10]，已成为现阶段苜蓿栽培过程中的重要限制因素之一。该病害可为害苜蓿全生育期，侵染根及根颈部位造成根部腐烂，致使根系分支减少，固氮能力降低，产量和品质下降，每年由苜蓿根腐病在全世界造成的苜蓿产量损失在20%左右，发病严重地块甚至达40%[11]。由于栽培区生态条件各异，根腐病病原种类有差别[12-13]，目前报道的病原有29种，其中镰孢属(Fusariumspp.)真菌有14种[14]，为引起该病害的优势病原，如黑龙江紫花苜蓿根腐病的主要病原为镰孢菌和丝核菌(Rhizoctoniasp.)[15]，内蒙古中部地区苜蓿根腐病的优势病原为镰孢属真菌[10]，甘肃省定西市苜蓿根腐病的病原为半裸镰孢菌(F.semitectum)、锐顶镰孢菌(F.acuminatum) 和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)[16]。近年来甘肃省武威市苜蓿种植面积越来越大，2017年年底保有面积1.78×104hm2，已成为产业结构调整的主要作物之一，但局部种植年限较长的田块根腐病发生较重，且武威市苜蓿镰孢根腐病的病原种类有待于进一步研究。因此，本研究对甘肃省武威市苜蓿镰孢根腐病的病原菌进行分离、致病性测定和鉴定，以期为该病害的田间诊断和综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 苜蓿根腐病标本

于2014年7月18日采自甘肃省武威市黄羊镇，取样田为种植3年的甘农3号，对地上部分有疑似根腐病症状的植株随机挖取10株进行根腐病的初步诊断和症状描述，并对根腐病标样带回实验室进行病原分离培养和鉴定。

1.2 症状描述

对紫花苜蓿根腐病地上及地下症状进行描述并拍照，包括颜色变化、腐烂情况等。

1.3 病原的分离和鉴定

1.3.1病原的分离 采用常规组织分离法在PSA培养基(马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂17 g、蒸馏水1 000 mL)进行分离培养与菌落边缘纯化，待边缘纯化的菌株产孢后进行单孢分离纯化，后转入PSA斜面保存备用[17]。

1.3.2致病性测定 采用浸根接种法进行致病性测定[17]。具体为将紫花苜蓿播种于塑料花盆中(直径12 cm)，在室温条件下培育至40 d苗龄，取出苗，冲洗干净根表面的泥土后将根部用6号昆虫针轻轻扎破表皮，再用分离物106cfu·mL-1的孢子悬浮液浸根15 min，再移栽于花盆继续生长；每个分离物重复3次，每次重复3盆，每盆5株，共45株；以无菌水浸根为对照。接种后连续观察植株发病情况，至有紫花苜蓿叶片黄化和开始落叶时挖出所有接种植株的根，统计发病植株，计算发病率，并对形成典型症状的植株进行再分离。

1.3.3病原菌的鉴定 将病原菌接种于PSA平板25 ℃下培养5 d后观察培养性状，产孢后观察分生孢子梗、厚垣孢子、大型分生孢子和小型分生孢子的形态特征，测量厚垣孢子、小型分生孢子和大型分生孢子大小(50个)，显微拍照。根据菌株形态特征，参考《镰刀菌属》[18]和《真菌鉴定手册》[19]等进行鉴定。

按参考文献[20]进行DNA提取，采用镰孢霉属真菌专用引物Fu3(5′-CCG AGTTTACAACTCCCAAA-3′)及Fu4(5′-TCCTCCGCT TAT TGA TAT GC-3′)[21](由华大生物工程有限公司合成)进行PCR扩增，扩增体系为DNA模板2 μL(以加2 μL双蒸水为空白对照)，2×MasterMix 25 μL，引物3 μL，加双蒸水定容至50 μL；扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。将具特异性条带产物送华大生物工程有限公司测序，所测序列在GenBank中进行同源性比对并下载同源性较高的序列，并采用Mega5.0邻接法(Neighbor-Joining)构建菌株系统发育树，明确其分类地位。

2 结果与分析

2.1 田间症状

该病害主要为害根，发病初期根及根颈部形成褐色坏死斑，之后病斑逐渐扩大，最后严重腐烂变为深褐色及黑色，深达维管束(图1)；植株地上部初期营养不良的表现，生长缓慢，叶片变黄枯萎，后期严重时枯死。

图1 苜蓿根腐病田间症状Fig. 1 Field symptoms of alfalfa root rot

2.2 病原菌的分离及致病性测定

根据分离物菌落形态、孢子和菌丝形态获得8个镰孢霉属真菌分离物，依次编号为WGF1、WGF2、WGF3、WGF4、WGF5、WGF6、WGF7和WGF8。经致病性测定，WGF2、WGF6和WGF7引致苜蓿根腐病的发病率为100%，致病力强；WGF1的发病率为75%，WGF3的发病率为50%，在发病部位可再分离得到与原接种镰孢真菌相同的分离物；接种WGF4、WGF5、WGF8和清水对照的紫花苜蓿无典型症状形成(图2)。该结果表明WGF1、WGF2、WGF3、WGF6和WGF7为紫花苜蓿根腐病的病原菌，且WGF2、WGF6和WGF7致病性强。

图2 致病性测定Fig. 2 Pathogenicity testing of the 7 isolates

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1形态学鉴定 WGF2和WGF6菌落正面气生菌丝多，中心淡黄色，背面中心呈橘黄色，边缘呈淡黄色；菌落圆形，直径7.9 cm(图3A、B)；产孢细胞单瓶梗；小型分生孢子纺锤形或哑铃形，大小(5.48～16.46) μm×(2.3～3.87) μm；大型分生孢子纺锤形或镰刀形，多为镰刀形，多3～5隔，两端为楔形，直或稍弯，大小(14.37～38.92) μm×(3.05～5.19) μm；厚垣孢子球形，直径(19.32～37.19) μm(图3C、D)。根据培养性状和形态特征[18-19]鉴定为半裸镰孢菌(F.incarnatum)。

WGF3菌落正面气生菌丝白色絮状，背面初期呈紫色，后期呈紫黑色；菌落圆形，直径7.5 cm(图4A、B)。分生孢子梗短，单瓶梗或多瓶梗；小型分生孢子卵圆形或椭圆形，大小(2.75～7.74) μm×(1.98～3.67) μm；大型分生孢子极少产生，有则多3～5隔，大小(13.41～39.49) μm×(1.3～43.92) μm(图4C、D)；不形成厚垣孢子。根据培养性状和形态特征[18-19]鉴定为层出镰孢菌(F.proliferatum)。

WGF1和WGF7菌落正面气生菌丝乳白色，发达，中央周围有气生菌丝塌陷，背面中心颜色略深，边缘颜色较浅；菌落圆形，生长5 d直径7.7 cm(图5A、B)；7 d形成分生孢子；产孢梗单瓶梗，大小(2.4～7.4) μm×(6.5～17.8) μm；大型分生孢子镰刀形，两端渐尖，具脚泡，大多为3～5隔，大小(14.5～32.2) μm×(3.4～5.1) μm；小型分生孢子大多为单孢，纺锤形或近椭圆形，较少，大小(8.3～18.7) μm×(2.4～4.4) μm；厚垣孢子间生或串生，圆形或近圆形，直径(7.1～29.7) μm(图5C、D、E)。根据培养性状和形态特征[18-19]鉴定为厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)。

2.3.2特异性基因序列分析鉴定 利用特异性引物分别对病原菌WGF2和WGF6基因组DNA进行PCR扩增，具特异性条带的扩增产物经测序，其序列分别长497和496 bp；将测序结果在GenBank中进行同源性比较，并用Mega(5.0)的邻接法构建系统发育树，WGF2和WGF6分别与半裸镰孢菌KY436233和KJ018790的同源性达100%，且在系统发育树上聚在一起(图6)。结合形态特征，将其鉴定为半裸镰孢菌。

图3 半裸镰孢形态特征Fig. 3 Morphological characteristics of F. incarnatum

A,菌落正面；B,菌落背面；C,大型分生孢子；D,厚垣孢子。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Macroconidia of the pathogen; D, Chlamydospore.

图4 层出镰孢形态特征Fig. 4 Morphological characteristics of F. proliferatum

A，菌落正面；B，菌落背面；C，大型分生孢子；D，产孢梗。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Macroconidia of the pathogen; D, Conidiogenous cell.

图5 厚垣镰孢菌形态特征 Fig. 5 Morphological characteristics of F. chlamydosporum

A，菌落正面；B，菌落背面；C，产孢梗；D，大型分生孢子；E，厚垣孢子。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Conidiogenous cell; D, Macroconidia of the pathogen; E, Chlamydospore.

提取WGF3基因组DNA，经特异性引物扩增后测序，获得532 bp的DNA片段，在GenBank中经同源性比较，与镰孢菌KU939075的同源性达99%，且在系统发育树上聚在一起(图6)。结合形态特征，将其鉴定为层出镰孢菌。

利用特异性引物分别对病原菌WGF1和WGF7基因组DNA进行PCR扩增，经测序WGF1和WGF7扩增产物分别长509和510 bp，在GenBank中经同源性比较，两病原菌与厚垣镰孢菌KY347905和KY347904的同源性达99%，且在系统发育树上聚在一起(图6)。结合形态特征，将WGF1和WGF7鉴定为厚垣镰孢菌。

图6 病原菌系统发育树Fig. 6 Phylogrnetic tree of WGF1，WGF2, WGF3, WGF6 and WGF7

3 讨论与结论

苜蓿根腐病是一种典型的土传病害，报道的病原达29种，其中优势病原为镰孢菌[14]，其中镰孢菌主要有茄镰孢(F.solani)、梨孢镰孢菌(F.poae)、燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)、半裸镰孢菌、黄色镰孢菌(F.culmorum)、链状镰孢菌(F.fusarioides)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、三线镰孢菌(F.tricinctum)、接骨木镰孢菌(F.sambucinum)、锐顶镰孢菌、尖孢镰孢菌、大刀镰孢菌(F.culmorum)和拟枝孢镰孢菌[17,22-23]。甘肃省定西市苜蓿根腐病主要由尖孢镰孢菌、半裸镰孢菌和锐顶镰孢菌[16]引起。本研究中仅分离到厚垣镰孢菌、层出镰孢菌和半裸镰孢菌，5株致病菌中厚垣镰孢菌和半裸镰孢菌各2株，层出镰孢菌1株，且没有分离到尖孢镰孢菌和锐顶镰孢菌，说明武威苜蓿根腐病病原种与定西市有差异，且厚垣镰孢菌和半裸镰孢菌为强致病力菌株。

菌物形态除了受基因组控制外，也受环境因素的影响，特别是部分形态特征因培养条件的变化而改变，在形态上表现出多样性，因此物种鉴定极大地依赖于鉴定者的经验，如本研究中厚垣镰孢菌的分生孢子在PSA培养基上大于PDA培养基上；另外，部分镰孢菌的产孢条件难以筛选[24]，增大了依据形态特征进行分类鉴定的难度，并且菌物形态特征上的相似性和许多菌株有性时期的未知性，在培养特征及形态特征上很难在种的水平上将其分类。因此，分子鉴定方法在菌物鉴定中得到进一步扩大和应用，以便提高种鉴定的准确性，特别是通过培养特征、表型特征和分子鉴定数据等综合资料和研究者的经验结合，可以较好地克服单一方法在菌株鉴定中的局限性，提高鉴定的准确性。分子鉴定方法中rDNA-ITS基因序列分析在鉴定真菌方面应用广泛，如王晓英和刘秀梅[25]综合镰孢霉属真菌rDNA18S、28S、5.8S及其区间序列ITS1和ITS2设计了镰孢霉属真菌专用引物Fu3/Fu4，该区间序列表达和调控保守，可以较好地区分镰孢霉属真菌在种一级的关系，本研究使用该引物对所分离的病原镰孢菌进行了鉴定，将5株引起武威市紫花苜蓿根腐病的致病菌分别鉴定为半裸镰孢菌、层出镰孢菌和半裸镰孢菌，丰富了苜蓿根腐病病原的资料，也为甘肃省武威市苜蓿根腐病的诊断和综合防治提供了依据。