NGF治疗兔骨筋膜室综合征神经损伤的作用研究

刘燚，张金龙，孙郁雨，崔志明

(南通市第一人民医院骨科，江苏 南通 226000)

随着社会科技的发展和进步，交通、施工等变得越来越便利的同时，外伤事故的发生率也随之增加。其中肢体损伤占很大的比例，而骨筋膜室综合征则是其中比较严重的创伤疾病之一[1]。众所周知，骨筋膜室综合征一旦延误治疗，轻者肌肉神经损伤、功能受损，重者需要截肢，甚至死亡。因此，早期诊断、早期治疗、早期康复已经成为治疗骨筋膜室综合征的共识。然而，目前大家的关注点多集中在早期手术切开减压等治疗方面，对神经损伤的早期治疗和预防关注不多。本研究通过建立兔的骨筋膜室综合征的动物模型，通过兔腿间隔筋膜室内压力动态监测，兔后腿神经标本的HE染色、免疫荧光等方法明确神经损伤的变化情况，并早期局部应用神经生长因子(nerve growth factor，NGF)进行干预，探求使用NGF早期预防和治疗骨筋膜室综合征神经损伤的时机和疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验于2016年9月至2017年12月在南通大学免疫实验室北区动物实验室完成。健康成年新西兰兔24只，雌雄不限，体重(2.5±0.3)kg(由南通大学动物中心提供)，自由进食颗粒状饲料及饮用自来水。实验室环境温度20～23℃，相对湿度55%～65%。试剂分别来自abcam、cell signaling等。

1.2 设计、实施、评估者 设计为全部作者，干预实施为第一作者和第二作者，评估为全部作者，均受过专业培训，采用非盲法评估。

1.3 方法 动物模型制备：参照Aydin F等[2]使用的“止血带”法建立兔骨筋膜室综合征动物模型。模型制作前准备：实验兔禁食12 h，禁饮4 h。麻醉药物：乌拉坦(200 g/L)，使用剂量：5 mL/kg，注射方式：耳缘静脉缓慢注射麻醉，注射速度：10 mL/15 min。操作前半小时予以兔后腿备皮，使用简易监测仪观察实验兔的基本生命体征。模型制作：止血带加压环扎实验兔已备皮的后腿，在止血带外再使用血压器袖带充气加压，固定8 h后松解止血带，兔后腿出现明显肿胀，骨筋膜室综合征动物模型制作成功。

1.4 兔腿间隔筋膜室内压力测定 使用Whiteside针刺装置监测小腿部骨筋膜室内压。操作前需准备物品：普通汞柱血压表、三通管、普通针头、注射器、生理盐水。具体操作：将血压表与三通管、针头、注射器连接完毕。将血压表与实验兔被测后腿放在同一平面。针头刺入兔腿胫前筋膜间隙内(注意不要刺入肌肉中)，注射器抽取空气通过三通管推入，同时注入少许生理盐水(保证针头在间隙内通畅而不被周围组织所阻塞)，三通管连接血压计后测量，即可显示实验兔腿的胫前筋膜室内压。

1.5 Western blot 切除新鲜的组织标本，并进行组织蛋白的提取，之后采用SDS-PAGE凝胶电泳分离组织蛋白质，行转膜印迹，待完全冷却后，将转印膜行丽春红染色30 s，然后dd H2O脱色2 min。最后行蛋白质免疫检测。扫描生物图像处理系统测定灰度、分析图像、量化灰度，然后进行分析，相同条件下重复3次实验，以减小误差。

1.6 HE染色分析

1.6.1 组织石蜡包埋切片 新鲜组织固定于4%多聚甲醛24 h以上。将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4 h，85%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精1 h，无水乙醇Ⅰ 30 min，无水乙醇Ⅱ 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯Ⅰ 5～10 min，二甲苯Ⅱ 5～10 min，蜡Ⅰ 1 h，蜡Ⅱ 1 h，蜡Ⅲ 1 h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出，按照包埋面要求放入包埋框，并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后取出常温保存备用。

1.6.2 HE染色 依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ 20 min，无水乙醇Ⅰ 10 min，无水乙醇Ⅱ 10 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸馏水洗。切片入Harris苏木素染3～8 min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1～3 min。将切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min，95%酒精Ⅱ 5 min，无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

1.7 免疫荧光实验

1.7.1 冰冻切片制片 新鲜组织固定于4%多聚甲醛24 h以上。将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°℃冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。将脱好水的组织取出，用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。将包埋台固定于切片机上，先粗切，将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度为8～10 μm。将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。-20℃保存备用。

1.7.2 切片染色 新鲜组织固定于4%多聚甲醛24 h以上；将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。将脱好水的组织取出，用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。将包埋台固定于切片机上，先粗切，将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8～10 μm。将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。-20℃保存备用。4%冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍；与二抗相同宿主的血清封闭30 min，PBS洗3遍；一抗4℃湿盒内过夜，PBS洗3遍；二抗室温2 h(避光)，PBS洗3遍；用DAPI染核10 min，PBS洗3遍，然后直接照荧光片。

2 结 果

2.1 实验动物分析 纳入动物数量24只，均进入结果分析，没有脱落。

2.2 胫前筋膜室内压监测情况 正常组兔腿筋膜室压力为(0.38±0.1)kPa，实验组兔腿伤后4 h筋膜室压力为(2.0±0.2)kPa，伤后8 h为(4.3±0.4)kPa，伤后1 d为(7.0±0.4)kPa，伤后3d为(4.9±0.3)kPa，伤后5 d为(4.5±0.3)kPa，伤后7d为(4.0±0.3 )kPa，伤后2周为(2.9±0.3)kPa，伤后4周为(0.6±0.1)kPa。结果示实验兔腿与正常兔腿的筋膜室压力间的差异具有统计学意义。在模型成功后实验兔后腿的筋膜室内压明显上升，在1 d时，筋膜室压力达到峰值，之后筋膜室压力逐渐下降(P<0.05，差异具有统计学意义)。

2.3 兔骨筋膜室综合征神经损伤后细胞增殖核抗原的变化 我们运用Western blot技术观察兔骨筋膜室综合征后PCNA时间依赖性表达，PCNA在对照组呈现出低表达，在兔骨筋膜室综合征4 h后开始上调，5 d时表达达到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐渐下降(见图1)。这些结果表明PCNA蛋白质表达上调是由于骨筋膜室综合征损伤诱导所致。

a Western blot结果

注：*代表与sham组(对照组)相比差异具有统计学意义

2.4 局部早期应用NGF治疗神经损伤的组织形态学检测 为了分析局部早期应用神经生长因子神经组织学和形态学的变化，我们运用石蜡组织切片进行HE染色来分析兔骨筋膜室综合征神经损伤后的病理学特征。结果发现：未注射NGF组在损伤后5 d，可见神经纤维断裂、水肿、空泡、形状不规则的组织形态，而给予NGF注射的实验组在同一时间点的组织形态要明显好于未注射组(见图2)。此实验逐步表明，在早期给予NGF注射可对兔骨筋膜室综合征神经损伤有一定的修复作用。

2.5 免疫荧光双标分析注射神经营养因子后不同的细胞标记物荧光的共表达 进一步明确注射神经营养因子对兔骨筋膜室综合征后与神经的恢复以及施旺细胞表达的状况影响，我们运用免疫荧光技术取正常组和实验组病变部位神经组织进行免疫荧光双标。施旺细胞是外周神经中的特异性细胞，与外周神经细胞的修复和增殖有密切联系。因此，考虑选择施旺细胞作为检测指标。分别用S100、DAPI标记施旺细胞以及细胞核，我们可以发现给予神经营养因子能够明显增加兔骨筋膜室综合征后神经细胞增殖数量，而通过荧光双标显示，给予NGF注射后，S100和DAPI共标明显增加。损伤5 d时，相对于对照组和未注射NGF组，NGF注射组中S100、DAPI的表达均明显增加(见图3)，而且两者共标亦明显增加，表明兔骨筋膜室综合征后注射NGF，明显促进了施旺细胞的增殖，进而促进神经损伤的修复。

a 对照组(×40) b 未注射NGF组(×40) c 注射NGF组(×40)

d 对照组(×200) e 未注射NGF组(×200) f 注射NGF组(×200)

图2 实验兔(对照组)、损伤后5 d(损伤未注射组)、损伤后5 d(损伤注射组)的兔后腿神经标本HE染色

a 对照组 b 未注射NGF组 c 注射NGF组

注：S100-绿色；DAPI-蓝色

图3 损伤后神经细胞和施旺细胞的共定位情况(×200)

3 讨 论

骨筋膜室综合征是四肢创伤中最为严重的疾病之一，多发生于四肢骨折后，少数无骨折仅软组织严重损伤时也可形成，血管损伤、烧伤、医源性损伤等均可引起。创伤后患肢肌肉、软组织剧烈肿胀，致使骨筋膜的间隔膨胀，间隔压力快速升高，肌肉、神经组织受压，继而出现张力性水疱、肌张力增高、肌肉大面积坏死、肢体感觉运动功能障碍等，严重时甚至引起多器官功能衰竭而导致死亡。因此，早期发现和及时手术是预防和治疗骨筋膜室综合征的重中之重。骨筋膜室综合征后神经损伤的出现概率较高，出现的时间也比较早，而目前判断神经损伤的方法多为肢体感觉运动情况的检查，并没有具体客观的检查指标，而且神经损伤的治疗方法也很有限，尤其是神经损伤的早期治疗多被忽视。本实验的目的就是通过骨筋膜室综合征动物模型研究早期神经损伤的时间、治疗以及疗效等。

动物试验模型中，通过对试验兔腿筋膜室压力的动态测量，我们发现松开止血带后筋膜室压力随之升高，在1 d时达到峰值，随后逐渐下降。我们运用Western blot技术观察兔骨筋膜室综合征后PCNA时间依赖性表达，PCNA在对照组呈现出低表达，在兔骨筋膜室综合征4 h后开始上调，5 d时表达达到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐渐下降。这些结果表明PCNA蛋白质表达上调是由于骨筋膜室综合征损伤诱导所致。实验表明骨筋膜室综合征早期即会引起神经损伤，并且在短期内会达到损伤的高峰。我们再运用石蜡组织切片进行HE染色来分析兔骨筋膜室综合征神经损伤后的病理学特征。结果发现损伤后5 d，可见神经纤维断裂、水肿、空泡、形状不规则的组织形态；而给予NGF注射的实验组在同一时间点的组织形态要明显好于未注射组。HE染色结果提示早期局部使用NGF对于神经损伤的预防和修复具有明显的效果。

在周围神经系统中，施旺细胞(Schwann cells，SCs)是外周神经系统具有特异性的神经胶质细胞[3-4]，在神经损伤后的修复过程中发挥十分重要的作用。施旺细胞可分泌多种神经营养因子、黏附分子、细胞外基质分子，形成周围神经再生的微环境，指导和支持神经的增殖和迁移[5]。周围神经损伤后，巨噬细胞浸润后形成炎症反应，清除碎片并调节微环境以允许有效的再生[6]。施旺细胞与巨噬细胞合作，通过某些受体介导的吞噬作用以及自噬来清除髓鞘碎片，在体内获得抗原呈递功能并调节局部免疫反应和周围神经疾病[7-8]。施旺细胞通过支持轴突生长和髓鞘形成在外周神经修复和再生中起关键作用[9-12]，是周围神经系统再生能力不可或缺的部分[12-13]。迄今为止，施旺细胞被认为是用于周围神经系统损伤或退行性疾病的活细胞疗法的最有希望的候选者[14]。

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种神经细胞生长的调节因子，具有营养神经和促神经生长的功能。它不仅仅作用于中枢神经系统，同时也在周围神经系统中发挥重要的调控作用[15]。既然NGF和施旺细胞均在神经细胞的修复过程中发挥着重要的作用，那么两者之间是否存在一定的联系？

为了进一步明确注射神经营养因子对兔骨筋膜室综合征后对神经的恢复以及施旺细胞表达的状况影响。我们运用免疫荧光技术取对照组和实验组病变部位神经组织进行免疫荧光双标。S100存在于培养的施旺细胞中并且可能对周围神经损伤发挥旁分泌作用，是施旺细胞的特异性标记物[16]。分别用S100、DAPI标记施旺细胞以及细胞核，我们可以发现给予神经营养因子能够明显增加兔骨筋膜室综合征后神经细胞增殖数量，而通过荧光双标显示，给予NGF注射后，S100和DAPI共标明显增加，表明兔骨筋膜室综合征后早期局部注射NGF可以促进施旺细胞增殖。施旺细胞的增殖可以促进髓鞘修复，诱导轴突再生，加速神经元的生长和修复，同时一定程度抑制神经细胞的凋亡，避免神经受损进一步加重。

骨筋膜室综合征的处理应着重于早期预防、早期诊断以及早期治疗。在临床治疗的同时，需要密切监测患肢神经的情况，对于早期可能会出现或者已经出现神经损伤表现的，早期连续局部注射NGF的治疗方法给广大医务工作者提供了一个选择。同时临床实际应用中存在着许多的不可预知性，药品的来源、给药技术、疗效评估、起效时间、不良反应、医源性损伤等方面均需要进一步的研究。但是我相信本实验不仅提供了一定的实验数据，更为临床治疗提供了新的理论和技术支持，具有广阔的应用前景。