毛细管PCR芯片电泳快速检测NDM-1耐药菌方法的建立*

王秋平

(南华大学附属第一医院检验科，湖南衡阳 421001)

滥用抗生素的问题由来已久，2000年出现了多重耐药假单胞菌和肺炎克雷伯菌。2010年8月The Lancet Infectious Diseases杂志报道了抗生素抗新德里金属-β-内酰胺酶(NDM-1)超级细菌。NDM-1是一种新鉴定的对β-内酰胺类抗生素具有广谱水解作用的酶，是编码碳青霉烯类酶基因家族成员之一。NDM-l可以水解碳青霉烯类抗生素，以及头孢菌素和青霉素。携带该基因的细菌对几乎所有一线治疗重症感染的广谱抗生素，如青霉素类、头孢菌素类、头霉素类等β-内酰胺和碳青霉烯类抗生素均耐药，仅对多黏菌素E及米诺环素衍生物——替加环素敏感，被称为“超级细菌”[1-2]。由于这类细菌的广谱耐药特性，有必要进行早期快速鉴定，从而为控制医院内感染和临床治疗提供及时准确的指导[3]。传统细菌耐药基因检测通常采用细菌分离培养和药物敏感性试验[3]，这些方法虽然有效，但由于检测时间较长，难以实现快速检测，临床工作中急需快速有效的NDM-1阳性细菌鉴定方法。采用毛细管聚合酶链反应(PCR)扩增试剂可以简化操作并缩短分析时间，满足快速检测的需要。本研究采用直接PCR扩增试剂MightyAmp DNA Polymerase，尝试将直接PCR扩增与微流控芯片电泳技术结合用于NDM-1阳性细菌快速鉴定，拟建立一种快速、高灵敏的检测方法，实现早期指导临床用药和控制医院内感染，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 (1)标本来源：收集本院2016-2017年对碳青霉烯类抗生素不敏感的80株肠道杆菌(美罗培南MIC≥2 μg/mL)和60株鲍曼不动杆菌(亚胺培南MIC≥64 μg/mL)。所有菌株使用法国梅里埃公司VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪进行鉴定和药敏试验检测。以大肠埃希菌ATCC 25922及铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质量控制菌株。(2)引物设计：根据参考文献[2]按基因序列(FN396876)设计PCR特异引物序列，上游：5′-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3′，下游：5′-CGCAACACA GCCTGACTTTC-3′，扩增片段长度286 bp。PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2试剂与仪器 宝生物工程(大连)有限公司的MightyAmp DNA Polymerase试剂盒，DL2000 DNA Marker，琼脂糖。江苏兴化宏泰硅氟制品厂的聚四氟乙烯毛细管，美国Bio-Rad公司MyCycler PCR扩增仪、电泳仪，英国UVI公司凝胶成像分析仪和紫外分析仪。美国贝克曼库尔特公司台式冷冻离心机，法国梅里埃公司VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪。研究采用塑型十字架结构聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)电泳芯片[4]，芯片的有效分离通道长度设定为4 cm，电泳分析激光诱导在荧光芯片分析仪上完成。该仪器由芯片电泳平台、光学检测系统、高压电源控制和操作软件组成，检测方式为共聚焦激光诱导荧光。毛细管PCR装置参考文献[4-5]。

1.3方法

1.3.1产NDM-1细菌的实验室筛查和表型确认 采用K-B纸片扩散法，(1)按照美国临床和实验室标准化协会的改良方法进行，制备菌液浓度为0.5麦氏浊度，采用无菌棉签取已制备好的菌液，在水解酪蛋白(M-H)琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周。平板置室温干燥3～5 min后用无菌镊子取美罗培南(10 μg)和亚胺培南(10 μg)纸片，检测美罗培南和亚胺培南的抑菌环直径。(2)乙二胺四乙酸(EDTA)协同试验筛选金属酶表型，0.5麦氏单位的待检菌涂布M-H平板，贴2张亚胺培南纸片，相距1.0～1.5 cm，其中一张纸片上面滴加0.5 mol/L EDTA 10 μL。35 ℃过夜培养，亚胺培南加EDTA与亚胺培南纸片抑菌圈之差≥5 mm者为金属酶阳性。

1.3.2产NDM-1细菌基因诊断 采用常规PCR检测，PCR扩增反应体系分别是MightyAmp DNA Polymerase酶0.5 μL，MightyAmp PCR Buffer12.5 μL，引物F(10 μmol/L)1.0 μL，引物R(10 μmol/L)1.0 μL，ddH2O 8.0 μL，菌液标本2.0 μL，总体积25.0 μL。在台式PCR仪上反应条件98 ℃，2 min,98 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s 40个循环。高效振荡流毛细管PCR检测：毛细管PCR反应体系同上，毛细管PCR反应条件：将上述PCR反应液振荡，充分混匀，毛细管PCR装置中毛细管顺序吸入5 μL矿物油和3 μL PCR反应液。液滴首先运动至98 ℃区停留2 min，继而在98 ℃和68 ℃区间往返运动40个循环。液滴运动速度为120 μL/min，每个循环在68 ℃区暂停10 s。毛细管PCR产物检测同上。PCR产物的电泳分析，琼脂糖电泳分析，配制2%琼脂糖凝胶板，按试剂标准操作配置2%的琼脂糖凝胶。取DNA相对分子质量标准液(DL2000)5 μL，直接上样。电泳仪电压为100 V，约30 min后停止电泳。置于UV紫外分析仪下观察并照相，根据扩增产物长度得出判断结果。微流控芯片电泳分析：用实验室自制的激光诱导荧光芯片分析仪检测。将PCR产物用无菌双蒸水稀释20倍。先利用真空泵让电泳缓冲液各10 μL灌满通道，同时将10 μL稀释后的样品加入样品池中。用1.2%HPMC作为筛分介质，缓冲液为1×PCR Buffer，电泳分离电压为1.2 kV，分离时间设定为300 s。采用50～800 bp DNA ladder Marker和待测PCR产物按1∶1比例在相同条件下进行芯片电泳，根据500 bp DNA ladder Marker和内标物(50 bp和800 bp DNA片段)的相对迁移时间确定待测样品中特异PCR扩增产物的DNA片段。微流控芯片利用DNA电泳分析，通过比较待测样品与标准样品的迁移时间确定DNA片段大小。

1.3.3微流控芯片法检测NDM-1耐药菌敏感度 细菌培养和计数-平板涂布计数法:将耐药菌接种于新鲜血平板上，培养18～24 h。将培养好的单个菌落从血平板上刮下来，溶于2 mL 0.45%的无菌盐水中，充分振荡混匀；分别在24个EP管内加入900 μL无菌生理盐水，排成3排，按顺序编号。从前面配好的菌液中取出100 μL加到第1个EP管内，则第1个EP管内细菌浓度为标本的1/10；同法，从第1个EP管中取出100 μL加到第2个EP管内，则第2个EP管内细菌浓度为标本的1/100。依此类推，第8个EP管细菌浓度为原标本的1/108。制备好营养培养基，高压消毒灭菌。将培养基溶解，待冷却50 ℃左右，倒入平板。取稀释好的菌液1 mL铺皿。35 ℃培养24～28 h后，看平皿上菌落数。选取细菌数量在30～300的菌液浓度进行计数。原菌液标本每毫升的细菌浓度=某一浓度3个平板的菌落总数/3×10(该浓度菌液的稀释倍数)(CFU/mL)。敏感度考察：将已经涂布平板中的原菌液标本按107、106、105、104、103、102、101、100梯度稀释，分别作为PCR模板，PCR反应体系和循环条件同前。考察免核酸提取PCR的敏感度。

1.3.4测序验证 将免核酸提取PCR产物送大连宝生物进行测序，用chromas145软件进行分析，并在Pub Med上与FN396876.1序列进行比对。

1.4方法学评价及临床标本检测 对毛细管液滴PCR反应体系和反应条件进行优化，分析评价该方法的特异度和敏感度；本研究采用碳青霉烯类酶阳性K-B纸片法和毛细管PCR结合微流控芯片电泳对本院检验科微生物实验室2016-2017年收集的80株耐药肠道杆菌(美罗培南MIC≥2 μg/mL)和60株鲍曼不动杆菌(亚胺培南MIC≥64 μg/mL)耐药菌进行筛查，并对耐药菌标本进行NDM-1基因检测。

2 结 果

2.1不同酶浓度对毛细管液滴PCR效果的影响 本试验比较4种酶用量，加入MightyAmp DNA Polymerase酶分别是0.1、0.3、0.5、0.7 μL，结果发现，酶的浓度与毛细管液滴PCR效果随酶浓度的增加而升高，当酶加入量为0.5 μL时趋向于饱和，因此，本试验酶加入量以0.5 μL为最优，见图1。

图1 试验酶加入量对PCR的影响

2.2不同标本量对毛细管液滴PCR效果的影响 为了考察MightyAmp DNA Polymerase酶的最合适检测标本体积，将不同菌液体积(1、2、3、5、7 μL)进行毛细管PCR。结果发现,标本加入量到5 μL时，PCR效率有所下降；当标本加入量为7 μL时，PCR受到明显抑制，并且有纤维凝固团产生,见图2。因此，最合适检测标本的体积为2 μL。

图2 标本量对毛细管液滴PCR的影响

2.3不同退火温度和延伸时间对毛细管液滴PCR效果的影响 为了考察在毛细管液滴PCR上退火温度和延伸时间对PCR效果的影响，将同一阳性标本采用同样的PCR反应体系，退火温度分别为62、65、68、71、74 ℃，比较芯片电泳荧光信号强弱。发现芯片电泳荧光信号退火温度为68 ℃较强，但不是最理想。每个循环中在68 ℃区暂停10 s，将退火和延伸加长，从而延长反应时间，芯片电泳荧光信号达最大值，PCR扩增效果相当成功，见图3、4。

图3 退火温度对毛细管PCR的影响

图4 延伸时间对毛细管PCR的影响

2.4临床耐药菌筛选、表型确认及毛细管PCR微流控芯片电泳结果 EDTA协同试验筛选金属酶结果显示，阳性6株，毛细管PCR微流控芯片电泳检测NDM-1阳性2株，同时进行普通PCR检测结果也是2株NDM-1阳性。携带NDM-1耐药菌在血平板上的培养情况见图5A；药敏纸片美罗培南和亚胺培南抑菌圈直径为6 mm≤22 mm，该耐药菌碳青霉烯类酶阳性，见图5B；K-B纸片结果为：EDTA复合纸片抑菌环直径25 mm，比单药纸片直径6 mm增大≥5 mm，因此该耐药菌金属酶阳性,见图5C。NDM-1阳性菌毛细管液滴PCR微流控芯片检测结果见图6；对应的琼脂糖电泳结果见图7。

图5 NDM-1阳性血平板培养和K-B纸片药敏试验结果

注：a为DNA marker；b为有NDM-1基因扩增产物；c为无NDM-1基因扩增产物

图6 NDM-1基因检测芯片电泳结果

注：M为DL2000 Marker；1为无NDM-1基因扩增产物；2、3为有NDM-1基因耐药菌扩增产物

图7 NDM-1基因检测琼脂糖电泳结果

2.5芯片毛细管液滴PCR特异性考察 经过试验优化，按最优PCR反应体系和反应条件，对该阳性PCR产物进行测序。芯片检测结果与测序结果在Pub Med上与FN396876.1序列进行比对，100%符合。

2.6芯片毛细管液滴PCR检出限考察 将已经涂布平板中的原菌液标本按107、106、105、104、103、102、101、100梯度稀释，分别作为PCR模板，PCR反应体系和循环条件同前。PCR产物在芯片电泳和2%琼脂糖电泳上检测。芯片电泳可以检测到最低菌液浓度为1.15×101CFU/mL,相比琼脂糖电泳最低菌液浓度1.5×103CFU/mL更灵敏。

2.7临床标本检测 本试验采用碳青霉烯类酶阳性K-B纸片法和毛细管PCR结合微流控芯片电泳对本院检验科微生物实验室2016-2017年收集的80株耐药肠道杆菌(美罗培南MIC≥2 μg/mL)和60株鲍曼不动杆菌(亚胺培南MIC≥64 μg/mL)耐药菌进行筛查，结果显示，K-B纸片法检出碳青霉烯类酶阳性6株，其中金属酶阳性2株；采用毛细管PCR结合微流控芯片电泳方法筛选出2株NDM-1基因阳性，并经DNA测序验证，确证携带NDM-1基因。

3 讨 论

“超级细菌”最早发现于2008年，源自一名印度籍的瑞典患者体内的一种细菌。由于多种抗生素对该细菌均无效，于是一种具有特殊性的基因被检测出来，这个基因就是NDM-编码基因[6]。碳青霉烯酶抗生素是革兰阴性菌医院内感染最后一线治疗药物，碳青霉烯酶耐药的产生将严重威胁到全球卫生治疗系统[7]。最近发现的NDM-1引起人类的广泛关注，也被大众媒体报道。尽管报道病例数非常少，影响还不是很大，但诊断实验室需要发展一种快速检测的方法，以备将来医院内感染暴发流行时应用。

目前，产NDM-1细菌的实验室常规诊断包括Etest法表型筛查试验、改良霍奇试验表型确证试验及自动化鉴定与药敏试验等，但是都无法区分耐药类型和耐药基因，且需要时间长，特异度低[8]。分子诊断检测方法弥补了常规方法的不足，可在1 h内完成检测，具有高敏感度和特异度。通常PCR前需要消耗大量时间进行标本DNA提取和前处理。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物需要进行琼脂糖凝胶的制备，而且电泳时间需要30 min以上，整个PCR操作过程不仅费时费力，而且还需要昂贵的仪器。

本研究采用的毛细管振荡流PCR装置，使用量注射泵驱动PCR液滴在不同恒定温区往返运动，因无需加热模块的升温和降温过程，所以大大缩短了PCR时间。并且，该系统使用标准毛细管作为PCR反应器，价格便宜，且毛细管PCR只需3 μL PCR反应液，节约试剂，大大降低了检测成本。本研究采用改良型Mighty Amp DNA聚合酶，直接从临床标本中扩增目的片段，无需核酸提取预处理，将标本直接进行PCR，有望实现集成化核酸分析。此外，本研究用微流控芯片电泳分析PCR产物，分离检测时间为300 s，相比常规琼脂糖电泳检测大大缩短了时间，而且本方法检测敏感度高，细菌检测敏感度为1.15×101CFU/mL。本研究中K-B纸片法检出碳青霉烯类酶阳性为6株，其中金属酶阳性2株；毛细管PCR结合微流控芯片电泳筛选出2株NDM-1基因阳性，同时进行普通PCR检测结果也是2株NDM-1阳性,经DNA测序验证，这2株确证携带NDM-1基因。另外4株可能含有碳青霉烯类酶的其他耐药基因型，还需进一步深入研究。本方法检测结果经过测序验证，完全符合，由此说明本方法对NDM-1基因检测准确性高、特异性强。

总之，该方法在40 min内实现产NDM-1耐药菌扩增产物的快速分离检测，细菌检测敏感度为1.15×101CFU/mL，对NDM-1基因检测准确性高、特异性强，具有快速、廉价等特点，适合超级细菌NDM-1的早期快速现场诊断。