转化生长因子-β1对肿瘤血管形成的影响*

马 锐，万巧凤，于 佳

(宁夏医科大学基础医学院，银川 750004)

正常机体在生理状态下血管新生是暂时的，并且机体严密监视、控制这一过程。但在病理条件下，血管内皮细胞促进血管生长的能力将使增生组织或细胞异常增殖。同时，血管形成受多种信号调控，这些信号能够调控血管生成的状态，包括基因突变、免疫细胞在局部浸润、代谢应激(如缺氧、酸中毒、碱中毒、低血糖)、增殖压力改变等。转化生长因子-β(TGF-β)有许多生物学作用，如参与胚胎发育、调节细胞的生长、增殖和分化，甚至诱导程序性死亡；另外，TGF-β还参与细胞外基质形成、抑制细胞因子产生，促进黏附分子表达，进而抑制免疫应答，修复受损组织等。TGF-β家族中研究最多的是TGF-β1，它是一种多功能生长因子，分布于多种组织细胞内，激活其下游的胞内信号蛋白，介导TGF-β1的信号传递，进而发挥重要生物学效应。有研究显示，在成纤维促血管生成中，TGF-β1信号通路可以诱导成纤维细胞表型发生改变，促进肌动蛋白α(α-SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)A表达,使成纤维细胞形成小管样结构[1]。有研究表明，TGF-β基因敲除的小鼠表现有血管发育缺陷，致胚胎死亡[2]。目前TGF-β对血管内皮细胞的作用及转导通路研究还比较少，GATA6能够与TGF-β基因的启动子结合，参与调控血管内皮细胞功能。而GATA6分子在血管内皮细胞内广泛表达，维持血管内皮细胞的生存和调节周围血管[3]，这些理论知识为利用TGF-β1刺激大鼠内皮细胞提供了有利条件。

1 材料与方法

1.1材料 SD健康雄性大鼠，6～8周，体质量160～200 g，购于宁夏医科大学实验动物中心。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(上海美轩生物科技有限公司)，TGF-β1(Invitrogen公司)，Matrigel胶(BD公司)，ECM培养基(Invitrogen公司)，全自动数码凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)，超净工作台(苏州苏洁医疗)，CO2恒温培养箱(博科公司)，生物安全柜(Thermo公司)，普通倒置显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠主动脉环形成试验 SD大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉后打开腹腔，迅速分离出大鼠的胸主动脉，若有出血，用纱布拭去，保持视野清晰(过程中注意无菌操作)；Matrigel胶提前从-20 ℃移至4 ℃冰箱过夜，将Matrigel胶加入48孔板中，并在37 ℃培养箱中放置30 min，使其凝固。小心将大鼠的胸主动脉结缔组织和脂肪剔除掉，注意不能剪破血管；放入盛有100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的冰磷酸盐缓冲液(PBS)中，再将动脉剪成小段，每段长度1～2 mm；用PBS清洗主动脉环，取出37 ℃培养箱中的48孔板，将动脉环小心接种到48孔板的Matrigel胶上；再将液态Matrigel胶覆盖于环上，形成夹心状；37 ℃培养箱中放置30 min，使其凝固；凝固后，在每孔Matrigel胶上层给予3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1(ECM培养基配制)的MDA-MB-231细胞培养基上清液，比较各种TGF-β1水平对大鼠主动脉环形成的影响。同一水平设3个复孔置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每两天换1次，每日拍照。

1.2.2新生血管分支长度比较 倒置显微镜观察大鼠主动脉形成的血管分支，对不同组别进行测量并统计。

2 结 果

2.1大鼠主动脉环血管形成试验 见图1。

注：A为3.125 ng/mL TGF-β1组；B为6.250 ng/mL TGF-β1组；C为12.500 ng/mL TGF-β1组

图1各种TGF-β1水平对大鼠主动脉环形成的影响(×120)

2.2不同水平TGF-β1刺激试验大鼠新生血管分支长度比较 诱导48 h后，3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1刺激试验大鼠主动脉环外周血管分支长度分别为(0.600±0.041)、(0.900±0.309)、(1.200±0.238)mm，差异有统计学意义(P<0.05)。表明MDA-MB-231人类乳腺癌细胞经TGF-β1诱导后，血管分支长度增加。

3 讨 论

目前，乳腺癌仍是导致女性死亡的重要疾病,虽然现代诊断和治疗技术不断提高，乳腺肿瘤患者病死率逐年下降，但其病死率仍高达35%。因此，筛选出具有早期诊断价值的靶标分子，对于改善预后意义重大。TGF-β1及其下游信号通路研究目前已成为肿瘤研究的热点[3-4]。作为DPC4基因的传递蛋白，TGF-β1已被证明DPC4突变或缺失与多种肿瘤相关。在肿瘤细胞分泌的众多因子中，何种因子介导内皮细胞从原有血管出芽形成新的肿瘤血管，并发挥的关键作用还不十分清楚。血管生成后，血管大量增殖，形成类似毛细血管网的细胞环状结构，这是肿瘤新血管生长的重要步骤。

目前已有许多药物针对血管生成靶向性方向治疗乳腺肿瘤，如索拉非尼[5]。在健康人体内，血管生成是被严格控制的，但在肿瘤组织中，血管生成迅速，一方面供给肿瘤组织营养，另一方面实现肿瘤细胞远端转移。因此，如何行之有效地切断肿瘤组织血管生成途径，已被研究人员公认为是治疗肿瘤的有效途径。尤其是某些促血管生成因子，可以在原有管腔内大量释放，这些因子似“诱饵”激活血管内皮细胞表面的相应受体，如VEGF-VEGFR结合、活化内皮细胞、释放水解酶及蛋白酶，发挥纤维溶解作用，溶解血管基底膜[6-7]。探明以上机制，对于肿瘤细胞如何最终形成管腔，以致成熟血管形成，具有重大现实意义。

本研究旨在研究TGF-β1对于乳腺肿瘤细胞血管生成的影响；为肿瘤细胞侵袭、远端转移等提供理论佐证，进而对TGF-β1及其受体、信号通路研究提供了前期基础[8-9]。在前期多次预试验的基础上，本研究分离出大鼠胸主动脉，并制作体外主动脉环试验模型，借助Matrigel胶模拟的细胞内基质环境，进行血管形成试验观察。48 h后经倒置显微镜比较发现，人类乳腺癌细胞MDA-MB-231经TGF-β1诱导后，血管出芽数量、密度增加，而且血管分支长度也增长。TGF-β1使MDA-MB-231人类乳腺癌细胞迁移和血管生成的能力增强，在后续研究中，作者将对其调控的分子机制进行进一步探究。