葡萄糖磷酸异构酶酶显色定量测定方法的建立及性能评估*

黄亚丽，赵 珂，魏 芳，马凯惠，李新华△

(1.山东大学齐鲁医院核医学科，济南 250062；2.山东省内分泌与代谢病研究所，济南 250012；3.山东中医药大学附属医院普外科，济南 250000)

类风湿关节炎(RA)是一种病因尚未完全阐明、以侵犯四肢小关节为主的自身免疫性疾病，RA早期即可产生不可逆的骨侵蚀和关节破坏，如果未得到及时治疗，RA患者在2～3年的致残率为60%～70%，因此,RA的早期诊断及规范化治疗极为重要[1-2]。近年研究发现，葡萄糖磷酸异构酶(GPI)可作为自身抗原,与自身免疫病尤其是RA密切相关[3]，且与活动期患者的疼痛及肿胀关节数呈正相关[4]。有研究表明，GPI可能通过与抗体复合物激活补体替代途径，诱发关节炎[5]。本文建立一种定量检测血清GPI的酶显色法，并对其进行性能评估，探讨此方法是否满足临床检测的需求，为RA 的临床早期筛查和诊断治疗提供技术支撑。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年12月至2016年9月山东大学齐鲁医院风湿科门诊和住院患者39例作为RA组，其中男13例，女26例，年龄20～83岁，平均(60±15)岁，所有患者均符合美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟2009年修订的RA诊断标准。另选取同期在山东大学齐鲁医院门诊就诊和住院的患者52例作为非RA组，其中男18例，女34例，年龄19～83岁，平均(54±17)岁，均符合国内或国际相应的诊断标准，其中系统性红斑狼疮23例，混合型结缔组织病2例，强直性脊柱炎6例，干燥综合征10例，未分化结缔组织病3例,多发性肌炎/皮肌炎5例，脊柱关节病2例，肠病性关节炎1例。选取在山东大学齐鲁医院体检健康者32例作为健康对照组，其中男10例，女22例，年龄26～81岁，平均(53±16)岁。排除GPI缺乏症患者，所有受试者均空腹采集静脉血3 mL，分离血清，-80 ℃冰箱保存备用。所有标本一次冻融后测定。

1.2仪器与试剂 Infinite M200 Pro多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司，PHS-3E型pH计购自雷磁公司，Tris购自美国Sigma公司，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgCl2)购自西陇化工股份有限公司，D-果糖-6-磷酸二钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、GPI标准品购自瑞士Roche公司，水溶性四氮唑盐购自南京旋光科技有限公司，柠檬酸、吩嗪硫酸甲酯(PMS)购自阿拉丁公司，乙基苯基聚乙二醇(NP-40)购自安耐吉公司；GPI ELISA试剂盒购自上海北加生化试剂有限公司。

1.3方法

1.3.1原理及操作步骤 (1)原理：根据D-果糖-6-磷酸二钠在GPI作用下生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸再与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与水溶性四氮唑盐发生颜色反应，在550 nm处有最大吸光度，吸光度值与GPI水平呈正比。(2)操作步骤：试验前10 min先将R1与R2以1∶1混匀，每孔吸取100 μL，再加10 μL标本37 ℃反应10 min，采用Infinite M200 Pro测定其在550 nm处的吸光度，根据GPI标准品制订的标准曲线计算出标本中GPI水平。

1.3.2试剂制备 配制稀释液A ：其中三羟甲基氨基甲烷1 210 mg/L，EDTA-Na2372.24 mg/L，KCl 3 725 mg/L，MgCl21 016.5 mg/L，用1 mmol/L的柠檬酸调节pH至8.05。试剂R1：果糖-6-磷酸1 200 mg/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸400 mg/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶5 mg/L,用配制稀释液A来溶解。试剂R2：水溶性四氮唑蓝20 mg/L，PMS 2 mg/L，NP-40 1 000 mg/L。试剂制备好均置于2～8 ℃保存备用。

1.3.3性能评价 (1)精密度(CV)与偏倚：抽取2个批次的检测试剂，分别对水平0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI质控品进行测定，每个水平重复20次，计算批内和批间各水平测试结果的CV，并统计各水平测试结果的偏倚情况。(2)干扰试验：分别检测标本添加200 mg/L胆红素、5 g/L血红蛋白、15 g/L三酰甘油前后的检测结果，结果相对偏差在±10%以内认为干扰物不影响标本测试。(3)稳定性试验：试剂置于2～8 ℃保存，14个月(试剂有效期12个月+延长2个月)内每个月分别测试水平为0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI质控品，每个水平重复10次，测试结果相对偏差在±20%以内认为试剂稳定性良好。(4)临床验证：用本试验方法检测123份临床血清标本，与GPI ELISA试剂盒检测结果比较，计算两种方法检测结果的相关性和偏差。

2 结 果

2.1GPI酶显色法定量测定的标准曲线 见图1。分析结果显示，线性范围内各水平与测试值呈平滑递增曲线，标准曲线为Y=0.042 9X+0.108 3，r2=0.992 3。

图1 GPI酶显色法测定的标准曲线

2.2GPI酶显色定量测定方法的精密度与偏倚分析 见表1。采用2批次配液同时测定，每个质控重复测定20次，批内与批间各检测水平CV<10%，且t检验显示各水平测试结果偏倚可接受(P>0.05)。

表1 两批试剂精密度与偏倚分析结果比较

2.3各干扰物加入前后测定结果比较 见表2。临床上对于血清测定的干扰因素主要有脂浊、黄疸和溶血。试验采用添加干扰物的方式进行，分别在高、中、低值血清中添加不同水平的干扰物质，该试剂在胆红素水平≤200 mg/L、血红蛋白水平≤5 g/L、三酰甘油水平≤15 g/L的情况下，各水平范围的平均偏差均在5%内，根据临床标准试验要求偏差应在±10%以内，完全在临床上使用的可接受范围内。

2.4稳定性试验结果比较 见表3。14个月内检测水平为0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI质控品，各水平相对偏差在±20%以内，试剂有效期>12个月。

2.5回收率测定 分析样品1(GPI水平0.30 mg/L)和样品2(GPI水平0.60 mg/L)重复测定5次，平均回收水平分别为0.31 mg/L和0.59 mg/L，回收率分别为103.3%和98.3%，平均回收率为100.8%。

表2 各干扰物加入前、后测定结果比较

表3 GPI的酶显色法定量测定稳定性试验结果比较

注：0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI质控品±20%分别为0.04～0.06、0.24～0.36、0.48～0.72 mg/L

2.6两种方法检测3组临床标本结果比较 见表4。分别采用酶显色法和ELISA试剂盒检测123份血清标本，均得到123份有效数据。两种方法在RA组(n=39)、非RA组(n=52)和健康对照组(n=32)间临床标本检测数据比较差异均无统计学意义(Z=-1.38，P>0.05)。

表4 GPI酶显色法与ELISA试剂盒检测3组临床标本GPI结果比较

3 讨 论

RA是一种免疫功能紊乱引起的自身免疫性疾病，患者体内存在多种自身抗原和自身抗体，其具体病因和发病机制目前尚不完全明确，探讨其发病机制对于RA的诊治和预防至关重要。GPI是一种广泛表达并且具有多种功能的蛋白质，它是能量循环和糖分解过程中必不可少的胞浆酶，同时它又是细胞外信号的传导分子[6]。GPI分泌运动因子和神经细胞因子，可能在肿瘤和自身免疫方面起一定作用[7-8]。GPI可诱导C57BL/10小鼠产生关节炎，疾病的发生与Ⅱ型主要组织相容性复合体相关[9]。GPI水平在RA活动组和非活动组差异有统计学意义(P<0.05)，与RA患者的关节肿胀、疼痛呈正相关。GPI对于RA疾病的早期诊断，了解病情的发生和发展、治疗及判断预后均有重要价值[8]。关于GPI及其抗体在RA中的诊断价值，大多数研究结果表明,GPI抗原诊断RA的敏感度>65%，特异度≥90%，有较高的诊断价值[9-10];而抗GPI抗体在RA诊断中的研究结果差异较大，特异度为64.3%～95.9%[11-12]。因此，临床实验室可选择合适的标志物联合检测来提高特异度和敏感度，更好地对RA 进行诊断及疗效观察。所以迫切需要一种能快速准确且敏感度和精密度高的检测GPI的方法来满足RA的临床诊断。

本研究建立了一种新的快速检测血清GPI的方法，检测线性范围为0.000 82～2.500 00 mg/L，在线性范围内有较好的精密度和准确度。稳定性试验结果显示，12个月内检测水平为0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI质控品，各水平相对偏差可控制在允许范围内，认为试剂有效期>12个月。干扰物胆红素(200 mg/L)、血红蛋白(5 g/L)、三酰甘油(15 g/L)不影响试剂检测。GPI酶显色法检测结果与ELISA试剂盒的测定结果有良好的相关性，且两种方法测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。

随着GPI检测项目在临床应用的快速开展，对于检测技术的快速准确和高效提出了新的要求。本研究建立的GPI酶显色法定量检测试剂敏感度、精密度和特异度较高，可重复性和稳定性较好，与GPI ELISA试剂盒的测定结果比较有较好的一致性。与现有同类产品相比，本研究的创新点在于：(1)可采用酶显色法对GPI进行定量检测；(2)操作简单快速，相比现有定量检测产品检测时间短；(3)无需配备大型仪器设备，使用成本相对低廉，适合于地方基层医院应用。本研究不足之处是标本量较少，仍需要收集更多的病例来验证该试验结果，还应同时开展深入大量的临床研究来确定不同地区、不同人种、不同实验室建立相应的诊断标准。