大豆卵磷脂替代卵黄的稀释液低温保存绵羊精液效果

赵建清 王 杰 李 娜 高庆华, 3*

(1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)(2 塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)(3 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

无动物源性添加剂稀释液的研究，可以提高无动物源性稀释液的长期保存效果，以及对研发不含动物源物质的羊低温保存精液的新型稀释液有很大帮助。无动物源性稀释液易制成粉剂，降低保存条件，减少成本,且成分明确，即非动物源性添加剂稀释液是今后研究的大方向。因为很多行业已经制定了相关政策，限制使用动物性原料[1]。而传统绵羊精液低温保存稀释液主要是以动物源性(卵黄)为抗冷保护剂，含动物源的精液保存液虽有比较理想的保护效果,却也有一定的弊端。国外有研究称精液稀释液中的卵黄会与一种来自尿道球腺的蛋黄凝固酶发生作用，不利于精子细胞生存[2-3]。卵黄中对精子起保护作用的主要是卵磷脂[4-6]，研究以大豆卵磷脂(SL)替代卵黄的稀释液，成为了现阶段研究的热点。大豆卵磷脂稀释液不仅成分确定，而且适合规模化生产。目前绵羊精液稀释液中添加大豆卵磷脂的报道较少，也还没有统一的添加量，卵黄中卵磷脂的含量约为10%[7]，实验室TRIS专利卵黄稀释液中卵黄占比约为23%，则TRIS专利卵黄稀释液中卵磷脂含量约为5%。本试验拟利用TRIS专利稀释液的基础液，以添加5%浓度的大豆卵磷脂为中间浓度，设置不同浓度的大豆卵磷脂组，来进行其对绵羊精液低温保存效果。

1 材料与方法

1.1 稀释液的制备与储存

以TRIS专利稀释液为基础，用大豆卵磷脂代替卵黄进行配制稀释液，混合均匀，每5 mL分装到试管中，在-80 ℃冰箱冷冻避光保存，稀释精液前将稀释液解冻备用。

TRIS专利卵黄稀释液按照配方进行制备，并在-80 ℃冰箱冷冻避光保存。

1.2 精液采集与保存

试验采用假阴道法采精，挑选12只3～4岁无繁殖障碍且体况良好的多浪羊盘羊高代杂交公羊，在采精前三个星期进行补饲。试验中将稀释液与采集的精液按照精液密度等温混合，对稀释后的精液进行活率检测，活率达到0. 7以上，将分装的试管放在37 ℃盛有水的烧杯中，水浴在冰箱中1. 5 h降温至0～4 ℃以内，并保存在冰水混合物中。

1.3 精液品质鉴定

精子活率检测：在冰箱中拿出试管需进行快速而轻的摇匀，取一滴精液滴在载玻片上，盖上盖玻片，先在显微镜下100倍视野中观察精子，后在400倍下进行检测，观察精子活率并记录。

精子顶体完整率检测：吸取10 μL精液滴于载玻片的一侧，用边缘光滑的另一张载玻片呈一定角度接触液滴，拉向另一侧而制成抹片，经8 min自然风干后，在福尔马林磷酸盐固定液中固定15 min，之后水洗干燥，用姬姆萨染液对抹片进行染色90 min，再用蒸馏水冲洗与干燥，显微镜下观察并记录顶体完整的精子数。

1.4 试验设计

1.4.1 比较不同浓度大豆卵磷脂替代卵黄作为稀释液中的防冷保护剂，在低温保存不同天数精子活率情况。试验共分6个组：(A1, 1. 25%; A2, 2. 5%; A3, 5%; A4, 7. 5%; A5, 10%)大豆卵磷脂组与TRIS专利卵黄稀释液(C)组将绵羊新鲜精液稀释分装并低温保存，在第0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d对精子活率与顶体完整率进行测定，选出大豆卵磷脂组中效果最优组。

1.4.2 对234只母羊同期发情处理，用大豆卵磷脂效果最优组与C组低温保存至第9 d的精液(精子活率大于0. 5)对234只饲养管理条件一致，体况良好，无繁殖障碍的发情母羊进行人工授精，大豆卵磷脂效果最优组(112只)、C组(122只)，用B超在第40 d检测受胎情况。

1.5 统计分析

受胎率用SPSS19.0统计软件进行卡方检验，精子活率和精子顶体完整率用单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示。P<0. 05表示差异显著，P>0. 05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度大豆卵磷脂稀释液与卵黄稀释液低温保存绵羊精液不同时间的精子活率

由表1可知，自第6 d起A1组精子活率显著高于A2、A3、A4、A5组(P<0. 05)，且精子活率随着大豆卵磷脂浓度的增加而下降；虽然从第3 d开始C组平均精子活率高于A1组，但A1组与C组精子活率在各时间点差异均不显著(P>0. 05)；各组稀释剂低温保存绵羊精液的精子活率随着时间的延长而下降，但A1、C两组精子活率在第9 d为0. 53±0. 06和0. 55±0. 03均大于0. 5，满足鲜精输精要求。

表1 不同浓度大豆卵磷脂稀释液与卵黄稀释液低温保存绵羊精液不同时间的精子活率

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0. 05)，相同字母表示差异不显著(P>0. 05)。

2.2 不同浓度大豆卵磷脂稀释液与卵黄稀释液低温保存绵羊精液不同时间精子顶体完整率

由表2可知，精子顶体完整率均随各组稀释液保存时间的延长而呈下降趋势，且各组在第6 d到第9 d精子顶体完整率下降较快。虽从第1 d开始A1组顶体完整率稍低于C组，但A1组与C组精子顶体完整率在各个相同时间点差异均不显著(P>0. 05)。

表2 各组稀释剂低温保存绵羊精液不同时间精子顶体完整率(%)

注：同列比较无字母出现差异不显著(P>0. 05)。

2.3 两组稀释液低温保存绵羊精液第9 d人工授精受胎率

由表3可见，A1组低温保存绵羊精液，在第9 d人工授精112只，有72只妊娠，受胎率达到64. 30%；C组第9 d人工授精122只，有80只妊娠，受胎率为65. 60%。由此可以确定，大豆卵磷脂稀释液与卵黄稀释液保存至第9 d的精液受胎率相近(P﹥0. 05)。

表3 两组稀释液低温保存绵羊精液第9 d人工授精受胎率

注：同列比较无字母出现差异不显著(P﹥0. 05)。

3 讨论

从本试验结果可以看出，1. 25%浓度的大豆卵磷脂稀释液从保存时间，精子活率随时间的变化规律，精子顶体完整率以及经大豆卵磷脂稀释液保存后的精液人工授精情况，都可以达到卵黄稀释液的效果，因此1. 25%浓度的大豆卵磷脂稀释液能够进行绵羊精液低温长时间有效保存。

大豆卵磷脂稀释液是近年稀释液研究的热点，Forouzanfar等[8]在冷冻保存绵羊精液试验中，发现用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黄，证明大豆卵磷脂可以替代卵黄。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低温与常温下保存绵羊精液，结果表明精子在卵黄中的运动性较差。本试验在0 ℃冰水混合物中保存绵羊精液，发现使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黄保存精子效果显著高于其他浓度(P<0. 05)，与蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最优添加量有一定偏差。所以证明为了确保精子的运动处于最好的状态，大豆卵磷的添加剂量必须有一定的限度。

本试验A1组与C组精子活率在第12 d分别为0. 46±0. 09和0. 49±0. 07，试验结果优于孟娜娜等[11]，略低于陈晓丽等[12]49. 51±1. 08。在第9 d时，A1组的精子活率为0. 53±0. 06，说明大豆卵磷脂稀释液在低温保存绵羊精液9 d内精子活率满足输精要求。A1组与C组在各个相同时间点精子顶体完整率差异均不显著(P>0. 05)，A1组在第6 d顶体完整率为83. 1±1. 2，略低于王杰等[13]保存6 d顶体完整率。顶体完整率随时间推移逐渐下降，且下降速率逐渐变大[14]，与本实验结果相似。

本试验低温保存第9 d人工授精受胎率达到64. 30%与65. 60%，试验结果优于丁瑜[15]使用大豆卵磷脂冷冻稀释液人工授精受胎率，可能是因为精子受到一定的冷打击，精子的受精能力有所减弱。本结果表明大豆卵磷脂稀释液对精子保存能力与TRIS专利卵黄稀释液差异不显著(P﹥0. 05)，大豆卵磷脂稀释液能够对绵羊精液低温长时间保存。

本试验在设计时，就以5%大豆卵磷脂浓度组为中间点，因为这与卵黄中卵磷脂的含量相当，结果也证明了5%大豆卵磷脂组的保存效果，但试验结果却为1. 25%大豆卵磷脂浓度组更好，其原因可能是：大豆卵磷脂的浓度的高低会影响精子的活力和复苏率，在较高浓度的溶液中对精子运动产生阻力较大，造成大量能量消耗，从而精子的存活率、活力等都大大降低。也可能是因为卵磷脂生产厂家、纯度等不同以及不同品种之间具有一定差异造成。所以推测是否在1. 25%浓度下还有更优的浓度组，需进一步试验验证。

4 结论

A1组(浓度为1. 25%的大豆卵磷脂稀释液)低温保存绵羊精液精子活率均高于其他浓度组(P<0. 05)；A1组低温保存绵羊精液精子活率第9 d(0. 53±0. 06)、12 d(0. 46±0. 09)与C组第9 d(0. 55±0. 03)、12 d(0. 49±0. 07)差异不显著(P﹥0. 05)，且顶体完整率相当(P﹥0. 05)；A1组低温保存第9 d的精液进行人工授精,受胎率64. 3%与C组65. 6%差异不显著(P>0. 05)。表明1. 25%浓度的大豆卵磷脂稀释液能够进行绵羊精液低温长时间有效保存。