流行性乙型脑炎病毒C基因的克隆与表达

张雪萍 米丽开姆·托合提尼亚孜 童剑军 何川川 余 娜 李有文*

(1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300) (2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的一种虫媒性人兽共患传染病[1]。人和多种动物均可感染本病，以猪群感染最为普遍[1]。病猪多引起非化脓性脑炎，病人最主要特征是中枢神经系统受害而出现意识障碍、惊厥等神经症状[2]。本病被世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。

乙型脑炎病毒是单股正链有囊膜的RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)[3]。病毒颗粒为球形，20面体对称，病毒外层有纤突。其基因组长约11 kb，编码3个结构蛋白(C、M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1,3]。C蛋白为病毒的衣壳蛋白，包裹病毒基因组，对病毒基因组起保护作用[3,4]，构成病毒衣壳，决定其形态。已有研究表明，黄病毒属病毒的C蛋白不显露在病毒颗粒表面，因此不能诱导宿主细胞产生病毒的中和抗体[5,6]。C蛋白主要参与病毒的组装与复制：例如JEV复制得到的大量正链RNA有一半与C蛋白结合形成未成熟的病毒粒子[7]；此外C蛋白还具有非结构蛋白的功能，研究发现C蛋白也是JEV感染抗病毒治疗的靶位点[8]。尽管如此，C蛋白的结构特点、作用机制及更多的生物特性还有待研究，因此本文克隆了JEV P3株的C基因，并表达了其蛋白，分析了其核苷酸和氨基酸结构特点，为进一步研究C蛋白的其他生物学功能和作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与菌种

乙脑病毒P3株基因组cDNA由华中农业大学曹胜波教授馈赠；感受态细胞E.coliDH5α、E.coliBL21、原核表达载体pET42b保存于新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室。

1.1.2 主要药品及试剂

2×Utaq PCR Mix (北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA连接酶 (大连宝生物科技有限公司)，琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒 (北京天根生物工程技术服务有限公司)，NdeI、XhoI(Thermo公司)，DNA 纯化试剂盒 (美国Omega公司)。Western blot 用DAB显色剂 (武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 主要使用仪器

琼脂糖水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，F250经济型加热制冷循环器(优莱博技术(北京)有限公司)，ZWY-103B恒温培养振荡器、ZXGP-B2160隔水式恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)，全自动凝胶成像分析仪、HC高电流电泳仪、T100 Thermal Cycler梯度PCR仪、 Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、 Mini-Trans-Blot电泳转印槽(Bio-Rad生命科学有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 原核表达载体的构建

(1)C基因的PCR扩增

参考GenBank中乙型脑炎病毒JaOArS982 (NC001437) C基因序列，设计C基因对pET42b载体的特异性引物，引物由武汉天一辉远生物科技有限公司进行合成。如表1 (下划线为加入酶切位点：NdeI/XhoI)。

表1 C基因特异性引物

以乙型脑炎病毒P3株基因组cDNA为模板，用C基因的特异性引物进行PCR扩增。100 μL扩增体系：模板4. 8 μL，上下游引物各2. 4 μL，5×PrimeStar Buffer 20 μL，DNTP Mixture 4 μL， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.2 μL，dd H2O 65. 2 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、57 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、72 ℃10 min，30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收(按照DNA回收试剂盒操作)。

(2)C基因与质粒的酶切与纯化

取C基因20 μL，pET42b质粒15 μL分别于两个离心管，分别加通用10xBuffer 4 μL，NdeI2 μL，XhoI2μL，加入水至40 μL，充分混匀后，放入37℃ 水浴锅中酶切3～4 h。酶切产物利用DNA纯化试剂盒纯化，保存备用。

(3) C基因与原核表达载体的连接与鉴定

将酶切纯化的C基因5 μL与载体1 μL于同一离心管中，加T4连接酶1 μL，10xT4buffer 1 μL，加水2 μL，于16 ℃水浴连接8～10 h。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5α并涂板培养12～14 h，挑菌摇菌，做菌液PCR鉴定，PCR阳性菌提取质粒，并做双酶切(NdeI/XhoI)鉴定，质粒送武汉天一辉远生物有限公司测序鉴定。

1.2.2 P3株C基因核苷酸及推测的氨基酸序列分析

C基因的测序结果利用软件DNAMAN和DNASTAR进行核苷酸同源性比较和遗传进化关系分析。并推测其氨基酸序列，做蛋白二级结构分析和分子量预测。

1.2.3 C蛋白表达及鉴定

(1)C蛋白的表达

取经鉴定构建正确的质粒1 μL，转化大肠杆菌感受态BL21，挑取单菌落后按正常蛋白电泳鉴定的方法鉴定，具体参考张孝忠等[9]的操作方法。

(2)Western Blot检测

对C基因的表达产物进行SDS-PAGE电泳。将胶块铲下，切成合适大小，置于用TBST Buffer浸泡滤纸上，其上盖同样大小的用TBST Buffer浸泡NC膜，其上再加滤纸。然后置转膜仪中，调电压至120 V，电泳30 min，将蛋白转至NC膜上。以His单抗为一抗，RHP标记的羊抗鼠抗体为二抗，用Western blot的常规操作方法进行检测，具体参考张孝忠等[9]的操作方法。

2 实验结果

2.1 C基因的扩增

JEV P3株C基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图1，C基因大小约381 bp，与理论大小相符。

图1 C基因PCR扩增

2.2 C基因的克隆与鉴定

构建的JEV C基因的克隆经菌落PCR鉴定，得到约381 bp的条带，初步鉴定克隆成功；其质粒做NdeI/XhoI双酶切鉴定，得到了约5 000 bp与381 bp(如图2 )的两条带，与理论相符，说明成功构建了C基因的表达载体PET42b-JEV-C；质粒测序结果表明JEV P3株C基因与参考株同源性97%以上，且表达框正确。

图2 重组质粒双酶切鉴定

2.3 JEV-C基因及其遗传进化特性分析

P3株C基因全长381 bp (如表2)，与对照JaOArS982同源性为97. 64%，其AT含量有50. 66%，序列中含有4个酶切位点(如表2左侧画横线处)。

表2 JEV-C的核苷酸序列及氨基酸序列

根据P3株的测序结果，与GenBank中发表的JEV-C的序列做遗传进化分析。对C基因进行遗传进化树分析(如图3)，发现C基因虽然形成5个分支，但各分支之间差异较小，亲缘性较近，说明JEV的C基因比较保守，这与其在病毒繁殖中重要的生物学功能相一致。P3株的C基因位于第IV组，遗传距离约1. 5。

图3 C基因遗传进化树

2.4 P3株C蛋白特性及二级结构分析

利用DNASTAR软件分析JEV P3株C基因编码127个氨基酸(如表2)，分子量大小13 KDa；从氨基酸组成上，25个强酸性氨基酸 (K,R)，5个强碱性氨基酸 (D, E)，53个疏水性氨基酸(A, I, L, F, W, V)，18个两性氨基酸 (N, C, Q, S, T, Y)，等电点为11. 89，在中性环境中带正电。C蛋白的二级结构分析 (图4) 发现C蛋白主要由β片层结构和α螺旋结构构成，中间有少量的β转角相连接。整个蛋白亲水性一般，有较强的抗原性。

图4 C蛋白二级结构分析

2.5 C蛋白的表达与检测

质粒pET42b-JEV-C在大肠杆菌BL21中蛋白表达结果显示：C基因以包涵体形式表达了大小13 KDa的蛋白 (如图5)，与理论值相符；以His单抗进行Western blot检测结果 (如图6) 说明C蛋白与His标签确实进行了融合表达，且表达结果正确。

图5 C蛋白表达检测

图6 C蛋白的Western blot 鉴定

3 讨论

JEV能够引起包括人等多种动物神经系统的疾病，是引起公共卫生安全事件的主要病原之一。

JEV基因组是一条线形RNA正链，由5’非编码区，蛋白编码区和3’非编码区组成，蛋白编码区只有一个开放阅读框编码一个多聚蛋白，在宿主细胞和病毒编码的蛋白酶共同作用下，将多聚蛋白切割成3个结构蛋白和7个非结构蛋白[10,11]。C蛋白是多聚蛋白N端的第一个蛋白，也是其中最小的一个蛋白，只有127aa，对病毒的组装和结合病毒RNA不被降解有重要作用。本研究对JEV P3株C蛋白的二级结构分析发现其中间为一长的α螺旋结构(49-99aa)，其中含有大量两性氨基酸，而两端由多个β片层结构构成(如图4)，富含荷电氨基酸，有利于结合病毒RNA。这个结果与Pareek等的研究结果一致。Pareek等研究发现C蛋白N端39aa，C端23aa对病毒的组装无影响， N端16aa的缺失突变不影响病毒的组装[12]，说明衣壳中环化序列不影响基因组的包装或病毒的组装，但影响病毒RNA 的复制。

JEV侵入宿主细胞之后，在酸性胞质中E蛋白结构改变释放出病毒基因组，病毒基因组被运送到内质网中进行复制，合成病毒多聚蛋白和增殖RNA，C蛋白与新合成的RNA结合成未成熟的病毒粒子通过高尔基体成熟后释放出细胞，整个过程均在细胞质中进行[13]。翟永贞等构建了融合表达GFP的JEV-C重组质粒转染的CHO细胞，在细胞质和细胞膜中发现较显著绿色荧光[8]，证明C蛋白可能确实与病毒的组装有关，也说明病毒的增殖是在细胞质中进行的。但是有研究证明JEV-C蛋白可以特异性的和核仁蛋白B23结合，并且发现JEV-C蛋白与B23的结合位点是氨基端残基Gly42和Pro43(表2右侧划横线处)，说明JEV-C是可以进入细胞核的，并且其42、43位的氨基酸是重要的结合位点[14]。同时，Ma等[15]对JEV-C蛋白变异株(42、43位的甘氨酸和脯氨酸被丙氨酸替代)研究发现在核仁中找不到C蛋白，这一结果进一步证明该位点对C蛋白定位于细胞核作用重大。更多研究证明JEV-C蛋白在细胞核的定位对于临床上病毒性脑炎的发病机制有着重要的意义[16]，也说明C蛋白除了作为结构蛋白之外还有更多非结构蛋白的生物学功能。本研究构建了pET42b-JEV-C的原核表达质粒，并成功表达C蛋白，说明JEV-C能够在大肠杆菌中较好表达，为进一步研究C蛋白的结构及其他生物学功能奠定了基础。