N5，N10—亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病合并2型糖尿病的相关性研究

2018-12-26何伟喜刘鹃锋刘志辉王平

中国当代医药 2018年31期

何伟喜刘鹃锋刘志辉王平

[摘要]目的探討N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病合并2型糖尿病的相关性。方法选取2017年1月～2018年9月我院收治的90例冠状动脉造影患者作为研究对象，其中正常者30例作为对照组，冠心病患者33例作为A组，冠心病合并2型糖尿病患者27例作为B组，均行N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与生化指标（总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇）检测。结果 A组患者总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇高于对照组（P<0.05）；A组患者高密度脂蛋白胆固醇低于对照组（P<0.05）；B组患者总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇高于A组和对照组（P<0.05）；B组患者高密度脂蛋白胆固醇低于A组和对照组（P<0.05）；对照组患者基因型为CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A组患者基因型为CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B组患者基因型为CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%），三组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组患者C等位基因频次>A组患者C等位基因频次>B组患者C等位基因频次（P<0.05）。结论 N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病合并2型糖尿病的关系密切。TT基因型越多，冠心病合并2型糖尿病的患病风险越高。

[关键词]N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；冠心病；2型糖尿病；相关性

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）11（a）-0041-03

Analysia of the correlation between the polymorphism of N5，N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene and coronary heart disease complicated with type 2 diabetes mellitus

HE Wei-xi LIU Juan-feng LIU Zhi-hui WANG Ping

Department of Cardiology， the First People′s Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the polymorphism of N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene and coronary heart disease （CHD） complicated with type 2 diabetes mellitus （DM）. Methods A total of 90 patients performed with coronary angiography treated in our hospital from January 2017 to September in 2018 were selected as the subjects. Among them， 30 patients were selected as normal control group. The 33 patients with CHD alone were classified into group A， and the rest 27 patients with CHD and type 2 DM were categorized into group B. They were all tested with N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and biochemical markers such as total cholesterol （TC）， triacylglycerol， fasting blood glucose （FBG）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）. Results The levels of TC， triacylglycerol， and LDL-C in group A were higher than those in the control group （P<0.05）. The HDL-C level in the group A was lower than that in the control group （P<0.05）. The TC， triglyceride， FBG and LDL-C in the group B were higher than those in the group A and control group （P<0.05）. The HDL-C level in the group B was lower than that in the group A and the control group （P<0.05）. The genotypes of patients in the control group were CC （95.0%）， CT （5.0%） and TT （0.0%）. In the group A， the genotypes were CC （68.8%）， CT （25.0%） and TT （6.2%）. In the group B， the patients′ genotypes were CC （27.8%）， CT （38.9%）， TT （33.3%）. After inter-group comparisons， there were statistical significance （P<0.05）. The sequence of frequency of C alleles was listed as control group， group A， and group B from high to low （P<0.05）. Conclusion The N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism is closely associated with CHD complicated with type 2 DM.The more TT genotypes are，the higher the risk of CHD with type 2 DM becomes.

[Key words] N5， N10-methylenetetrahydrofolate reductase； Gene polymorphism； Coronary heart disease； Type 2 diabetes mellitus； Correlation

冠心病是临床常见病，高发于老年人[1-2]，可直接危及患者的生命安全。合并2型糖尿病会明显增加患者的临床治疗难度，分析其机制，可能与机体代谢紊乱、血流动力学指标改变等诸多个体因素有关[3-4]。N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶发生基因错位突变后，可引起酶缺乏或生物活性降低，可引发高同型半胱氨酸血症，进而诱发动脉粥样硬化，增加冠心病风险。因而，分析N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病合并2型糖尿病的相关性，具有重要的临床价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年1月～2018年9月我院收治的90例冠状动脉造影患者作为研究对象。其中正常者30例作为对照组，男14例，女16例；年龄46～75岁，平均（58.5±5.2）岁；冠心病患者33例作为A组，男21例，女12例；年龄45～76岁，平均（62.±4.8）岁；冠心病合并2型糖尿病患者27例作为B组，男19例，女8例；年龄48～73岁，平均（61.7±4.6）岁。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已经景德镇市第一人民医院医学伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。

纳入标准：符合冠心病诊断标准[5]，经冠状动脉造影证实在左主干、左前降支、回旋支或右冠状动脉中至少有1支血管狭窄程度>50%；符合2型糖尿病诊断标准[6]，空腹血糖>7.8 mmol/L，餐后2 h血糖>11.1 mmol/L。排除标准：患有继发性高血压、自身免疫性疾病、心力衰竭、严重肝肾功能不全、非汉族及其他恶性疾病的患者。

1.2方法

1.2.1样本收集采集被检人员空腹9～12 h肘静脉血10 ml。一管EDTA抗凝，混匀后，在-80℃下保存，用于提取基因组DNA，另一管肝素抗凝，用于生化指标检测。

1.2.2生化指标检测采用全自动生化分析仪检测，指标包括总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。严格按照说明书进行操作。

1.2.3 N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测 MTHFR C677T基因分型检测工作由上海联吉医学检验所有限公司承担，检测方法为核酸芯片杂交法。①DNA提取。使用亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒（PCR-RFLP）提取DNA，严格按照说明书进行操作，将提取后的DNA保存于-20℃冰箱中，试剂盒均购自于深圳奥萨制药有限公司。②PCR扩增和检测。引物设计可使用Primer 3 Input网络软件，由上海生工生物合成，上游引物为5′-ATGACCTGCTGCCGTCAGCG-3′，下游引物为5′-CCGCAACTATGGCATCGAGC-3′。反应体系为25 μl，包括模板DNA3 μl，PCR扩增混合液21.8 μl和Taq DNA聚合酶0.2 μl。应用PCR基因扩增仪进行扩增。94℃预变性3 min，94℃变性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环。循环完毕后，72℃再延伸7 min，酶切后电泳。对PCR扩增产物理想的样品进行酶切分析。反应体系为15 μl，包括PCR产物10 μl，Hinf I内切酶（深圳奥萨制药有限公司）0.3 μl，酶切缓冲液4.7 μl，在37℃下温育1 h，酶切反应终止后，其产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，室温恒压1～5 V/cm，电泳10 min，最后在凝胶成像仪下观察并照相，进行基因分型。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验或Z检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组患者生化指标的比较

A组患者总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇高于对照组（P<0.05）；A组患者高密度脂蛋白胆固醇低于对照组（P<0.05）。B组患者总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇高于A组和对照组（P<0.05）；B组患者高密度脂蛋白胆固醇低于A组和对照组（P<0.05）（表1）。

2.2三組患者基因型和等位基因频次的比较

对照组患者基因型为CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A组患者基因型为CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B组患者基因型为CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%）。三组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

对照组患者C等位基因频次>A组患者C等位基因频次>B组患者C等位基因频次（P<0.05）（表2）。

3讨论

近年来，随着医疗科技水平的不断提升，基因检测技术逐渐应用于临床，筛查基因突变也作为了发病因素进行相关疾病的诊疗，取得了显著效果[7-8]。诸多研究显示，高同型半胱氨酸血症是冠心病的独立危险因子[9-11]，因而，检测同型半胱氨酸水平，有助于诊疗冠心病，并改善患者的预后。N5， N10-亚甲基四氢叶酸还原酶是影响同型半胱氨酸代谢的关键酶之一，MTHFR基因C667T突变有可能下调酶的热稳定性，从而导致同型半胱氨酸水平升高，可能是冠心病的易感基因[12-13]。

在糖尿病患者中，N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性发生改变，主要为MTHFR基因C667T突变，即胸腺嘧啶T取代了胞嘧啶C，使得氨基酸发生错译，降低了MTHFR的生物活性，并增加了热敏感性，减少了5-甲基四氢叶酸的生成，阻碍了重新甲基化的进程，会造成同型半胱氨酸水平升高，更易引起血脂水平改变[14-15]，而C等位基因对血脂有保护作用，T等位基因具有危害作用，即随着T等位基因的增加，患者的患病风险将升高。

本研究结果显示，A组患者总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇高于对照组；A组患者高密度脂蛋白胆固醇低于对照组；B组患者总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇高于A组和对照组；B组患者高密度脂蛋白胆固醇低于A组和对照组。提示冠心病合并2型糖尿病存在明显的血糖、血脂水平改变。

对照组患者基因型為CC（95.0%）、CT（5.0%）、TT（0.0%），A组患者基因型为CC（68.8%）、CT（25.0%）、TT（6.2%），B组患者基因型为CC（27.8%）、CT（38.9%）、TT（33.3%），三组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。对照组患者C等位基因频次>A组患者C等位基因频次>B组患者C等位基因频次。提示N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病合并2型糖尿病的关系密切，TT基因型越多，冠心病合并2型糖尿病的患病风险越高。

综上所述，开展MTHFR基因C667T多态性检测，可以了解冠心病合并2型糖尿病患者的病情严重程度，从而降低主要心血管不良事件的发生风险，有助于改善患者的临床预后，提高其日后的生存质量和生存期，同时MTHFR基因C667T多态性检测还可降低医疗费用，提高医院设备的运转率，使得医患双方互利，能取得更好的社会效益，也为临床精准治疗提供了更多的循证医学依据。

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