miR-202、AFP及DKK1在原发性肝癌患者血清中的表达及其意义

韩 悦，魏殿军

（天津医科大学第二医院检验科，天津 300211）

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是肝细胞发生的恶性肿瘤，与肝硬化、病毒性肝炎密切相关，目前其病因及发病机制尚不明确。调查发现，PHC发病率较高，在世界恶性肿瘤中处于第5位，死亡率为第2位[1]。在我国，PHC高发于东南沿海地区，是危害人们身心健康的一大杀手。据统计，我国PHC病人的中位年龄为40～50岁，男性多于女性，其死亡率约为98%，略高于PHC全球死亡率，且死亡人数占到肝癌全球死亡人数的一半以上[2]。由于PHC早期症状不显著，患者被确诊时已是中晚期，因而错过了最佳治疗时期，即使获得根治性治疗，5年内仍有60%～70%的患者出现复发[3]。PHC病情发展加快会导致患者肝功能衰竭，晚期癌细胞大量增殖，扩散至周围组织及远处器官，如门静脉、肺部、脑部等，恶化程度加剧。及早发现并治疗可提高PHC患者的生存率，改善生存质量。本研究通过检测肝癌患者血清中微小RNA-202（micro RNA-202,miR-202）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、分泌性蛋白 Dikkopf-1（secreted protein,DKK1）的水平，运用ROC曲线分析3个指标联合检测诊断PHC的价值，探究提高临床诊断PHC准确性的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年6月—2014年12月天津医科大学第二医院肝病科收治的43例PHC患者（PHC组）、37例良性肝病患者（良性肝病组）及51例同期健康体检人员（健康对照组）。根据原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）[4]对PHC进行诊断，并经病理检查确诊为PHC。PHC组男性25例，女性18例，年龄29～76岁，平均年龄（54.2±4.9）岁；良性肝病患者男性22例，女性15例，年龄32～77岁，平均年龄（53.9±6.1）岁，其中肝囊肿18例，肝血管瘤19例；健康对照组男性29例，女性22例，年龄30～81 岁，平均年龄（56.2±8.3）岁。纳入标准：（1）患者初次确诊；（2）之前未接受任何治疗。排除标准：（1）合并神经性疾病或语言交流障碍者；（2）妊娠或哺乳期妇女；（3）有其他恶性肿瘤疾病患者；（4）有自身免疫性疾病患者；（5）药物性肝病或病毒性肝病患者；（6）临床依从性较差患者。3组受试对象在性别（χ2=0.060，P=0.971）、年龄（F=1.590，P=0.207）上比较，差异无统计学意义，具有可比性（P＞0.05）。本研究经天津医科大学第二医院医学伦理委员会批准，所有受试者均知晓本次研究并签署知情同意书。

1.2 方法 分别采集3组受试对象清晨空腹静脉血 10mL，3500r/min 离心 10min，分离血清，于-80℃保存。采用实时荧光定量PCR法（qPCR法）检测3组受试者血清miR-202含量，先提取血清总RNA，加入引物后，根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。分别在95℃、95℃、60℃预变性30 s、3 s、30 s，共40个循环，miR-202的相对表达量以2-△△Ct表示。用实时荧光定量PCR仪扩增定量，用PCR检测试剂盒进行定量检测；采用电化学发光法检测血清中AFP水平；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中DKK1水平。所有操作均严格按照产品说明书要求进行。

1.3 实验仪器与试剂盒 总miRNA提取试剂盒、miRNAs逆转录试剂盒、miR-202引物（5′-GCTGGAG AGGTATAGGGCA-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′）、内参（5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′） 及探针和miRNA荧光定量PCR检测试剂盒（赛默飞世尔）；灭酶EP管（上海俊晟生物科技有限公司）；干浴锅（上海汗诺仪器有限公司）；实时荧光定量PCR仪（达安基因）；紫外可见分光光度仪（菲勒仪器有限公司）；AFP试剂盒、DKK1试剂盒（武汉明德生物）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件处理本实验研究数据，计量数据不服从正态分布，则用中位数和四分位数间距M（Q1，Q3）表示，3组间数据比较采用Kruskal-WallisH检验；运用受试者工作特征曲线（ROC 曲线）分析 miR-202、AFP、DKK1及联合检测诊断PHC的诊断效能；采用Pearson相关分析研究miR-202、AFP及DKK1的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-202、AFP及DKK1在PHC组、良性肝病组及健康对照组血清中的表达 PHC组患者血清中miR-202水平低于良性肝病组和健康对照组，有显著性差异（P＜0.05）；AFP和DKK1水平均高于良性肝病组和健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组受试对象血清中miR-202、AFP和DKK1表达水平比较（x±s）Tab 1 Comparison of the levels of miR-202,AFP and DKK1 expression in the serum of the three groups（x±s）

2.2 血清miR-202、AFP及DKK1诊断PHC的效能 联合检测诊断PHC的效能高于miR-202、AFP及DKK1单独检测，且联合检测的ROC曲线下面积最大，为0.917。ROC曲线下面积比较，AUC联合检测＞AUCmiR-202（Z=2.075，P＜0.05），差异具有统计学意义；AUC联合检测＞AUCAFP，AUC联合检测＞AUCDKK1，差异无统计学意义（Z值分别为 1.812，1.202，P均＞0.05）；AUCmiR-202＜AUCAFP，AUCmiR-202＜AUCDKK1，差异无统计学意义 （Z值分别为-0.743，-1.261，P均＞0.05）；AUCAFP＜ AUCDKK1，P＞0.05。详见图 1、表 2 和表 3。

图1 miR-202、AFP、DKK1及联合检测诊断PHC的ROC曲线Fig 1 Thereceiveroperatingcharacteristiccurves(ROC)formiR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

图2 miR-202、AFP及DKK1的相关性Fig 2 Correlation between miR-202,AFP and DKK1

2.3 miR-202、AFP及DKK1的相关性分析 miR-202与 AFP 呈负相关（r=-0.314，P=0.005）；miR-202与 DKK1 呈负相关 （r=-0.319，P=0.004）；AFP 与DKK1 呈正相关（r=0.556，P＜0.001）。

表2 联合检测miR-202、AFP及DKK1对PHC的诊断价值（%）Tab 2 The diagnostic value of combined detection of mir-202,AFP and DKK1 for PHC(%)

表3 miR-202、AFP、DKK1及联合检测诊断PHC的ROC曲线下面积Tab 3 Area under the receiver operating characteristic curves(ROC)for miR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

3 讨论

PHC的发生发展是多种因素参与、分阶段进行的过程，早期不易发现，仅有少部分患者经确诊后可以治疗，因而造成PHC患者预后不良。目前，临床诊断PHC仍以影像学检查和肝组织活检病理检查为主，然而两者均有不足之处。CT、MRI联合检测及B超筛查对患者无创伤，但其判断误差较大，需具备良好生理解剖知识及丰富影像学鉴定经验的医师来完成[5]；肝组织活检的准确性相对较高，但易给患者带来创伤、出血风险，临床上应用受到限制[6]。可见，PHC传统的诊断方法存在局限，寻找肿瘤细胞筛查的新途径显得尤为重要。研究发现，血清学标志物水平检测近年应用较为广泛[7]。

有研究报道，多种miRNAs在肝癌组织中存在异常表达，在众多miRNAs中，miR-202位于10q26的脆性位点，与大脑肿瘤、子宫内膜存在密切关联[8-9]。报道指出，miR-202在多种疾病中表达存在异常（如食管癌、胃癌），但关于其在肝癌中表达的报道较少[10]。本研究中，PHC患者血清中miR-202水平显著低于良性肝病组和健康对照组，这与Zhang等[10]的研究结果基本一致，说明miR-202在肝癌发展过程中起到抑制癌基因的作用。Fu等[11]研究发现，血清中的miRNA稳定性较好，难以被降解，且其具备一定的组织特异性，因此miRNA-202可以作为潜在的生物标记物对PHC进行诊断。本研究结果显示，miRNA-202单项诊断PHC的准确性为73.75%，说明仅凭miRNA-202诊断PHC易造成误诊和漏诊。

AFP为临床上常用的肝癌标志物，AFP在正常成人血清中含量极微，但有报道指出，约有50%～60%的PHC患者AFP表达升高，且AFP在肝炎及肝硬化患者中也有不同程度的升高[12]。本研究中PHC患者AFP水平高于良性肝病患者健康受试者，此结果与上述研究一致。血清AFP诊断PHC的敏感度为69.77%，特异性为70.27%，结果与Sakr等[13]研究结果类似。另外，AFP诊断PHC的ROC曲线下面积相比较而言不是很高，可能原因是癌变时的肝细胞受到低甲基化干扰，从而使其合成的AFP表达处于开放化状态，提示单独应用AFP诊断PHC存在一定的误诊及漏诊率。

DKK1是由266个氨基酸组成的一种分泌型糖蛋白，其能与相应的受体结合并调控细胞的分化、增殖、凋亡及迁移，在肿瘤发生方面具有重要作用。研究指出，DKK1在乳腺癌、胃癌等中表达水平降低，而在肝癌、肺癌中的表达升高。本研究发现，与良性肝病组和健康对照组相比，PHC组患者血清中DKK1水平升高，提示DKK1可用于PHC的诊断。DKK1对PHC诊断的敏感度为83.72%，特异性83.78%，结果与既往研究存在差异[14]。由于单项肿瘤标志物诊断PHC的敏感度及特异性均难满足临床早期诊断及预后评估的要求，所以在实际工作中推荐应用联合检测。AFP、miRNA-202、DKK1 3项指标联合检测诊断PHC的AUC提升至0.917，高于AFP、miRNA-202、DKK1单独检测。因此认为三者联合检测在PHC诊断方面更具优势[15]。此外，3个指标相关性分析发现，miR-202与AFP、DKK1均呈正相关，AFP与DKK1呈正相关，提示三者血清水平存在联系。

综上所述，miR-202、AFP及DKK1联合检测可以提高PHC诊断的准确性，为临床诊治PHC提供参考依据。然而本研究样本量小，后续将扩大样本量并进一步探究3个指标在PHC中的作用机制。