miR-27a对胃癌细胞凋亡影响的体外研究

张悦，管叙文，王婧雅，黄鼎智

（天津医科大学肿瘤医院消化肿瘤内科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060）

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其死亡率位于恶性肿瘤第二位[1]。虽然胃癌治疗方式有一定进展，但预后并没有得到相应的改善。近年来，肿瘤治疗进入了靶向治疗新时代，随着对胃癌发生、发展分子机制的深入探索，靶向药物在胃癌中的应用逐渐增多[2]，但尚未有突破性的结果，因此寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是一种小分子非编码RNA，可通过与靶基因mRNA分子 3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）结合而影响肿瘤细胞的生物学行为。miR-27a位于人19号染色体上，属于miRNA-23a-24-27a簇，已证实在肾细胞癌、肝细胞癌、神经胶质瘤及乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达上调，参与调控细胞增殖、凋亡、分化等病理生理过程[3-6]。有文献报道miR-27a在胃腺癌中高表达，并通过与抑制素基因靶向结合而抑制胃癌细胞生长[7]。笔者前期的研究表明miR-27a在胃癌中表达显著上调，进一步的预后分析显示miR-27a高表达者预后欠佳[8-9]。以上研究结果提示miR-27a在胃癌中可能发挥了癌基因的作用。叉头框蛋白O1（forkhead box transcription factors O 1，FOXO1）是FOXO家族中研究较为成熟的一员，在肿瘤或其他疾病中发挥了重要的作用。研究表明，FOXO1在一些肿瘤中可作为miRNA的靶基因，如在乳腺癌中，miR-27a、miR-182及miR-96可以协同靶向抑制FOXO1表达，进而促进了细胞增殖并参与了细胞周期转换[10]。在肺癌中，miR-411通过沉默FOXO1表达促进肺癌细胞增殖[11]。基于上述研究背景，本实验旨在探讨miR-27a对胃癌细胞株SGC-7901的凋亡作用，同时研究敲低FOXO1对胃癌细胞凋亡的影响，并对miR-27a与FOXO1的关系进行验证与分析，以期为胃癌治疗新靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC-7901购自北京协和医科大学细胞资源中心；Trizol Reagent，lipofectamine 2000 Reagent购自美国Invitrogen公司；SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit购自大连宝生物公司；miR-27a mimics质粒、miR-27a mimics对照质粒、miR-27a inhibitors质粒、miR-27a inhibitors对照质粒、si-FOXO1质粒及si-FOXO1对照质粒均购自上海吉玛公司；FOXO1一抗购自美国Abcam公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司；报告基因质粒购自美国Progada公司；细胞凋亡Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 SGC-7901细胞培养于含有10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于培养皿中，按照说明书用lipofectamine 2000转染试剂盒分别转染miR-27a mimics质粒，miR-27a mimics对照质粒，miR-27a inhibitors质粒，miR-27a inhibitors对照质粒，si-FOXO1质粒及si-FOXO1对照质粒，细胞培养24～48 h后进行后续的实验。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率-Annexin V/PI双染色法 收集胃癌细胞SGC-7901到10 mL的离心管中，每样本细胞数为3×106/mL，1 000 r/min离心5 min后弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min。用100 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次。加入Annexin V-FITC/PI溶液，4℃下孵育20 min。最后补400 μL PBS，随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。加入Annexin V-FITC/PI溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动。随即进行流式细胞仪分析，流式细胞仪激发光波长488 nm，用波长515 nm的通带滤器检测FITC荧光，用波长大于560 nm的滤器检测PI。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则无此特性。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。

1.2.3 Western blot检测 p53、BCL-2、LC3I、LC3II及FOXO1蛋白表达 收集转染后48 h的SGC-7901细胞，加入RIPA细胞裂解液后离心收集SGC-7901细胞中总蛋白，经10%-15%SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，4℃、5%脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗，4℃孵育过夜。TBS-T洗去一抗，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，TBS-T洗涤3次，ECL试剂盒显影，以β-actin作为内参。

1.2.4 双荧光素酶报告基因试验 根据生物信息学预测结果得到miR-27a的潜在靶基因FOXO1，同时得到miR-27a在FOXO1基因3′UTR中结合位点，将含有靶位点的3′UTR序列及突变型3′UTR序列进行全基因合成，然后将目的序列构建至荧光素酶报告基因载体,将miR-27a表达质粒单独转染或者与荧光素报告载体共转染至SGC-7901细胞。转染后48 h以酶标仪检测荧光素酶的活性。

1.2.5 RNA的提取及Real-time PCR检测 采用Trizol试剂提取SGC-7901细胞总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。根据SYBR@PrimeScript@miRNA RT-PCR Kit试剂盒说明书加入500 ng的总RNA及逆转录反应所需试剂。得到的逆转录产物用相应的PCR引物在定量PCR仪进行实时定量PCR。PCR条件为95℃5 s，60℃34 s，进行40个循环。miR-27a PCR引物序列上游：5′-CGGCGGTT TCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-CCAGTGCAGG GTCC GAGGTAT-3′；FOXO1 基因引物序列上游 5′-TGGACATGCTCAGCAGACATC-3′，下游：5′-TTGG GTCAGGCGGTTCA-3′；β-actin基因引物序列上游：5′-ACACCTTCTACAATGA GCTG-3′，下游：5′-CAT GATGGAGTTGAAGGTAG-3′。

1.3 统计学分析 所有数据都至少来自3组独立的实验。数据处理采用SPSS软件，计量资料用x±s表示，所有统计结果以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 上调miR-27a及敲低FOXO1对胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡的影响 Annexin V/PI双染色法可以区分不同凋亡时期的细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，左上象限表示机械损伤细胞（Annexin-FITC-/PI+）；左下象限显示正常活细胞（Annexin-FITC-/PI-）；右上象限是凋亡中晚期细胞（Annexin-FITC+/PI+）；右下象限为早期凋亡细胞（Annexin-FITC+/PI-)。凋亡率为右上象限与右下象限细胞占总细胞数的比例。实验结果如图1A，miR-27a过表达组及其对照组细胞凋亡率分别为16%、29%，表明miR-27a过表达可显著抑制SGC-7901细胞凋亡（P＜0.05）。而如图1B所示，FOXO1低表达组及其对照组细胞凋亡率分别为5%、10%，表明FOXO1低表达亦显著抑制SGC-7901细胞凋亡（P＜0.05）。

图1 上调miR-27a或敲低FOXO1抑制胃癌细胞凋亡Fig 1 Over-expression of miR-27a or low-expression of FOXO1 inhibited gastric cancer cell apoptosis

2.2 上调 miR-27a及敲低FOXO1对胃癌细胞SGC-7901 p53、BCL-2、LC3I及 LC3II的表达水平的影响 Westernblot检测结果显示，敲低FOXO1组，FOXO1蛋白表达较对照组下调（P＜0.05）；相对各自的对照组，上调miR-27a组及si-FOXO1组凋亡相关蛋白p53表达水平下降，BCL-2表达上调，自噬相关蛋白 LC3I、LC3II表达下降（P＜0.05）（图 2）。

图2 上调 miR-27a及敲低 FOXO1后 p53、BCL-2、LC3I、LC3II蛋白表达变化Fig2 Changes in expression of p53,BCL-2,LC3I and LC3II in miR-27a over-expression and FOXO1 low-expression

2.3 miR-27a靶基因的验证 通过生物信息学方法，用靶基因预测数据库TargetScan、miRDB及miRanda网站预测miRNA-27a的靶基因,获得潜在的靶点FOXO1。Realtime-PCR检测结果显示miR-27a高表达质粒、miR-27a低表达质粒转染至胃癌细胞后miR-27a水平分别上调、下调，表明了miR-27a高表达质粒、miR-27a低表达质粒成功转染至胃癌细胞中。应用双荧光素酶报告基因验证，结果显示，在野生型FOXO1 3′UTR组，miR-27a高表达组的荧光素酶活性比相应的对照组低，miR-27a低表达组的荧光素酶活性则比相应的对照组高（P＜0.05）。而在突变型FOXO1 3′UTR组，miR-27a高表达或低表达后荧光素酶活性与对照组相比并没有明显变化（P＜0.05）（图 3）。

图3 验证miR-27a与FOXO1之间的靶点关系Fig 3 Verification of target relationship between miR-27aand FOXO1

2.4 miR-27a对胃癌细胞SGC-7901中FOXO1表达的影响 Realtime PCR结果显示，相对于各自对照组，上调或下调miR-27a后，SGC-7901细胞中FOXO1 mRNA水平无明显变化（P＞0.05）。转染miR-27a mimic组细胞中FOXO1蛋白水平较其对照组低（P＜0.05），转染miR-27a inhibitor组细胞中FOXO1蛋白水平较其相应对照组高（P＜0.05）（图 4）。

图4 miR-27a在蛋白水平上负性调控FOXO1的表达Fig 4 miR-27a negatively regulated the protein expression of FOXO1

3 讨论

近年来，miRNA在人类肿瘤研究领域获得较多关注。miRNA是一种非编码短链RNA，通过与靶基因mRNA 3′UTR完全或不完全碱基互补配对，促进靶基因mRNA的降解或抑制靶基因的翻译，发挥了癌基因或抑癌基因的功能。目前miR-27a在胃癌中的体内外研究多集中于其对肿瘤细胞增殖、侵袭迁移能力及细胞周期阻滞的影响，而针对细胞凋亡的研究尚属空白。因而本研究对miR-27a在胃癌细胞凋亡中的作用及作用机制进行了初步探索。

细胞凋亡是由基因控制的程序化细胞主动死亡，在调节机体正常发育和维持稳态中发挥重要作用。肿瘤细胞存在凋亡逃逸，从而获得了无限增殖的能力。本研究对转染miR-27a过表达质粒的中分化人胃腺癌SGC-7901细胞株的凋亡情况进行了研究，结果显示，在胃癌细胞中miR-27a过表达可以显著抑制细胞凋亡，提示miR-27a在胃癌的发生发展中发挥了癌基因的作用并可作为潜在的胃癌治疗新靶点。

FOXO是FOX家族中的O亚族，是生理及病理状态下均发挥重要作用的转录因子，由FOXO1、FOXO3、FOXO4及FOXO6组成，4个成员各自发挥着不同的功能[12]。研究表明FOXO1在乳腺癌、肺癌、原发性肝癌、骨肉瘤等肿瘤中呈低表达，可通过调控下游的肿瘤相关基因的表达而参与细胞增殖、凋亡及转移等过程，发挥着抑癌基因的功能[10，13-14]。Reagan-Shaw等发现抑制乳腺癌细胞中PI3K表达后，FOXO1表达上调，进而促进了细胞凋亡和导致细胞周期阻滞[15]。本研究中敲低SGC-7901细胞中FOXO1表达后得到了与转染miR-27a mimics类似的实验结果，即FOXO1表达下调抑制胃癌细胞凋亡。提示FOXO1可以为胃癌治疗提供新的方向。

通过生物信息学方法得到miR-27a潜在的靶点FOXO1，目前研究亦提示在一些肿瘤中miR-27a与FOXO1存在靶点关系[10，15]。本研究应用双荧光素酶报告基因进行了验证，结果表明pre-miR-27a前体能够显著降低野生型FOXO1 3′UTR组质粒的荧光活性，而对突变型FOXO1 3′UTR组质粒没有影响，最终证实了FOXO1是胃癌SGC-7901细胞中miR-27a的靶基因。进一步研究显示上调/下调miR-27a后，SGC-7901细胞中FOXO1mRNA水平无明显变化，FOXO1蛋白水平相应下调/上调，这提示miR-27a能够在蛋白翻译水平负性调控FOXO1蛋白的表达。由此推断：mi-R27a通过抑制靶基因FOXO1的表达抑制胃癌细胞凋亡。

BCL-2是细胞凋亡相关研究中研究最多的一种抗凋亡蛋白。而p53蛋白是重要的细胞凋亡调控因子，可以监视DNA损伤及诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。据文献报道BCL-2能够抑制p53介导的凋亡[16]。本研究应用Western blot法对上调miR-27a/敲低FOXO1的胃癌细胞中BCL-2及p53水平进行检测，结果显示BCL-2表达上调，p53表达下降，由此进一步印证了miR-27a抑制胃癌细胞凋亡及FOXO1促进细胞凋亡的结论。同时可以推断，BCL-2通过抑制p53的表达参与了miR-27a/FOXO1轴对胃癌细胞凋亡的影响过程，进而促进胃癌的发生发展，但其中的作用机制尚需深入研究。

肿瘤细胞受细胞程序性死亡的调控，而凋亡和自噬是程序性死亡的两种形式，且凋亡和自噬有着密切的关系。有文献报道，葡萄籽原花青素可以通过调控ROS表达而诱导凋亡和自噬，当加入3-MA抑制自噬时,葡萄籽原花青素诱导细胞凋亡的能力下降，表明了自噬可以促进凋亡[17]。本研究对上调miR-27a/敲低FOXO1的胃癌细胞中自噬相关蛋白LC3I、LC3II进行检测，结果表明 LC3I、LC3II表达下降，由此我们可初步推断miR-27a过表达及si-FOXO1可以抑制自噬而抑制胃癌细胞凋亡，从而在胃癌的进展过程中发挥重要作用。

由于胃癌早期筛查及诊断率低，多数胃癌患者在被确诊时已为晚期，化疗为主要治疗手段，但因原发或获得性耐药的出现，胃癌治疗陷入瓶颈。由于胃癌具体的发病机制未被阐明，故尚无良好的靶点。本研究分析了miR-27a对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其作用机制，初步得出了mi-R27a可通过靶向抑制FOXO1的表达抑制胃癌细胞凋亡的结论，这提示mi-27a/FOXO1轴可以作为胃癌治疗的新靶点。