组蛋白H3K4甲基转移酶KMT2D研究进展

阎晗，于明航 综 述，尹洁，王玺 审 校

（天津医科大学细胞生物学系，天津 300070）

表观遗传学在调控基因表达上扮演重要角色。组蛋白H3K4的甲基化是细胞修饰启动子和增强子的1种方法。组蛋白H3K4的三甲基化（H3K4me3）主要聚集在转录活跃的启动子区域，而一/二甲基化（H3K4me1，H3K4me2）则主要集中在增强子区域[1]。酵母菌中，Set1复合物中的催化亚基SET1，具有组蛋白H3K4的甲基转移酶活性，参与组蛋白H3K4的 me1，me2，me3 的修饰[2-3]。在果蝇中，dSet1、Trx和Trr是已知的3种Set1样组蛋白H3K4甲基转移酶。哺乳动物体内存在6种Set1样H3K4甲基转移酶，分别是 KMT2A（MLL1）、KMT2B（MLL2）、KMT2C（MLL3）、KMT2D（MLL4、ALR、MLL2）、KMT2F（SET1A）和KMT2G（SET1B）。KMT2D对于基因调控起到重要作用，其突变导致多种发育疾病和肿瘤的发生。本文对哺乳动物中最主要的H3K4单甲基化转移酶-KMT2D进行探讨，以期为探究疾病治疗的新方法提供思路。

1KMT2D蛋白

如图1所示，KMT2D蛋白的结构包括N-末端的两组植物同源结构域（PHD）（每组包含3个PHD），C-末端的SET结构域负责组蛋白H3K4的甲基化[3]。体外实验表明，第2组PHD（PHD4-6）识别核小体的H4尾巴，对于KMT2D-催化组蛋白甲基化起决定作用[4]。SET结构域的突变和缺失导致KMT2D蛋白的不稳定，表明SET区域不仅具有酶催化活性，并且对于维持蛋白稳定性至关重要[5-6]。在SET结构域上游是一个PHD区域和富含苯丙氨酸和络氨酸（FY-rich）N/C-末端（FYRN 和 FYRC）区域。此外，还包含一个高速泳动族非组蛋白（HMG-1）和九个核受体相互作用基序（LXXLLs）[7]。体外实验表明，氨基酸Y5426和Y5512对于人KMT2D的酶活性起决定性作用[6]。人胚胎干细胞（ESCs）中KMT2D的Y5426突变后，KMT2D会失去酶活性，但并不影响KMT2D蛋白的稳定性[5]。

图1 人类组蛋白H3K4甲基转移酶KMT2D蛋白

2KYM2D蛋白复合物

KMT2D是首次在Hela细胞核提取物一个蛋白复合体中分离纯化出来的。对Pax反式激活结构域作用蛋白（PTIP，一种与组蛋白H3K4甲基转移酶类相关的蛋白）相互作用蛋白的亲和纯化研究表明，PTIP除了与DNA损伤应答有关的蛋白质相互作用外，还与 ASH2L、RbBP5、WDR5、DPY30、NCOA6、UTX（KDM6A）、PA1、KMT2C和KMT2D有关联[8]（图2）。纯化的KMT2C和KMT2D表现出强H3K4甲基转移酶活性[9]。WDR5、RbBP5、ASH2L 和 DPY30 形成4个亚基的子复合物WRAD，此复合物对于所有哺乳动物中Set样组蛋白甲基转移酶复合物的酶活性起关键作用[10]。WDR5直接与KMT2C和KMT2D的C-末端FYRN/FYRC区域结合[8]。PTIP和PA1是KMT2C和KMT2D复合物中独特的亚基，除此之外还包含一个特殊的亚基UTX，它介导组蛋白H3K27的去甲基化[11]。缺失KMT2D将导致细胞中KMT2D复合物的解体和UTX的不稳定。

图2 KMT2D蛋白复合物

3 KMT2D主要催化组蛋白H3K4一甲基化

增强子是顺式作用元件，常与细胞型特异转录因子（TFs）结合，在真核细胞中对于特异基因的表达至关重要[12]。研究表明，KMT2D主要是通过其酶活性对细胞增强子区域进行H3K4—甲基化修饰，与KMT2C有功能冗余[13]。Lee等[13]运用ChIP-Seq研究，表明KMT2D在不同的细胞类型和分化水平，选择性的结合在特异增强子区域。在细胞分化期间，转录因子（TFs）募集KMT2D与特异增强子结合。在未分化的KMT2C敲除细胞中，KMT2D基因缺失引起H3K4me1/2和H3K27乙酰化水平降低，转录辅助因子和RNA聚合酶II结合增强子的能力减弱，导致基因表达和细胞分化受阻。此外，KMT2D还识别超级增强子。在细胞分化过程中KMT2C和KMT2D对于超级增强子的形成是必须的[14]。

KMT2C和KMT2D对于H3K27乙酰转移酶CREB-结合蛋白（CBP）和/或p300与增强子区域的结合、激活增强子、增强子-启动子成环、活化启动子，这一系列生物学过程是必须的[14-15]。由于乙酰化和甲基化往往是互相排斥的，可以推论，KMT2C和KMT2D复合物中的UTX亚基催化组蛋白脱甲基形成一个H3K27位点后，CBP和/或 p300对H3K27位点乙酰化（H3K27ac）。但是，研究表明UTX的H3K27脱甲基酶活性对于增强子活化和细胞特异基因表达是非必须的，其功能主要是与KMT2C和KMT2D形成复合物后作用于增强子[16]。

H3K4me1、H3K27ac是活化的增强子的标志[1]，基于此论断，提出KMT2D与增强子作用的三步式模型，如图3所示，过氧化物酶体增殖物活化受体-γ（Ppar-γ）的增强子活化过程。（1）转录因子，如C/EBPβ，与增强子区域结合。（2）C/EBPβ 和特异转录因子，如PPARγ和C/EBPα，共同募集KMT2D与增强子区域结合，催化H3K4—甲基化。(3）KMT2D促进CBP和/或p300的结合，活化增强子区域，使其标记乙酰化H3K27。转录因子和乙酰化的H3K27可募集bromodomain结构域结合蛋白4（BRD4），进而招募RNA聚合酶II，从而活化特异基因表达。

图3 KMT2D调控Ppar-γ增强子，诱导特异基因表达的三步式模型

4 KMT2D在细胞发育、分化、新陈代谢和肿瘤抑制方面的作用

KMT2D在哺乳动物细胞中参与许多生命活动的进程，如发育、分化、新陈代谢和肿瘤抑制。其主要功能是通过激活增强子从而调控基因的表达。

4.1 发育和分化Kmt2d基因敲除的小鼠呈现出E9.5（胚胎第9.5 d）胚胎致死[13]。运用Myf5启动子驱动的Cre转基因小鼠，特异敲除肌肉和褐色脂肪前体细胞中的Kmt2d基因，导致褐色脂肪组织和肌肉质量的显著下降，说明KMT2D在肌肉和脂肪组织发育中起重要作用[13]。特异敲除心脏前体细胞和心肌细胞中的Kmt2d基因导致严重的心脏缺陷和胚胎致死[17]。心脏发育进程中，KMT2D介导的H3K4me1/2在特异基因表达中有重要作用[17]。在B细胞发育过程中，KMT2D也扮演重要角色[18]。此外，KMT2D调控神经元和成骨细胞分化过程中特异基因的表达[4，19]。研究发现，KMT2D对于细胞命运转变有重要作用，但对于胚胎干细胞和成体细胞的维持是非必须的[15]。

4.2 新陈代谢 在肝脏中，KMT2D与KMT2C也存在功能冗余，二者在多种新陈代谢过程中发挥显著作用。Kmt2d+/-杂合小鼠，表现出糖耐受性、胰岛素敏感性的增强，其血清胆汁酸水平升高[20]。Kim等[20]运用RNA-Seq分析发现，KMT2D和KMT2C对于肝脏生理节奏的表观遗传调控至关重要，作为生理节律转录因子视黄酸-相关孤儿核受体（ROR）-α和-γ的转录辅助因子发挥重要作用。该课题组实验表明Kmt2d+/-小鼠表现出对高脂饮食诱导的肝脂肪变性的抵抗性[21]。

4.3 肿瘤抑制 大量研究表明，KMT2C和KMT2D具有肿瘤抑制作用。相关实验表明，NCOA6和KMT2C或KMT2D作为抑癌基因p53转录辅助因子，是在DNA损伤药物阿霉素作用细胞后，内源性p53基因表达所必须的[22]。小鼠体内研究表明，KMT2C和KMT2D在急性髓系白血病、滤泡性淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤中起到抑制肿瘤的作用[23-24]。Chen 等[23]运用 RNAi和 CRISPR/Cas9 技术，研究发现KMT2C基因表达水平低于大约50%会诱发白血病。Zhang等[24]在Kmt2d敲除的小鼠中，过表达致癌基因Bcl2，导致生发中心来源的B细胞淋巴瘤的发生率上升。Ortega-Molina等[18]研究表明，敲除小鼠B细胞中的Kmt2d，会影响抑癌基因TNFAIP3,SOCS3和TNFRSF14的表达，并进一步诱发淋巴瘤。

另一方面，有研究发现，在乳腺癌和结肠癌中，KMT2D缺失会降低癌细胞增殖率[25-26]。此外，在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，KMT2D活性升高会促进染色质解螺旋招募转录因子，如雌激素受体（ER）。在 MCF7细胞中，AKT结合并磷酸化KMT2D，使其甲基转移酶活性和ERα活性降低[27]。研究发现，加入PI3K抑制剂使AKT失活，导致雌激素受体目的基因表达上调，会降低乳腺癌药物的治疗效果[27]。研究表明KMT2D在不同细胞类型中具有多种功能，这可能取决于基因活化过程中KMT2D招募的特殊的转录因子结合基因组的特异位点。

5 KMT2D突变导致发育疾病和肿瘤发生

已证明KMT2D基因突变是引发Kabuki综合征最常见的原因。序列分析结果显示，Kabuki综合征患者中，KMT2D基因突变率高达56%～75%[28]。此外，先天性心脏病患者表现出大量的调节H3K4甲基化水平的基因的突变，其中包括KMT2D基因[29]。Ang等[17]发现，敲除小鼠Kmt2d基因将导致心脏发育缺陷。

KMT2D基因作为最常见的突变基因之一出现在多种癌症中[30]。研究发现，在恶性肿瘤中，KMT2D基因的SET和PHD区域的突变，其中37%是移码突变，60%是无义突变[7]。KMT2D基因突变导致多种组织发生癌变[7]，如成神经管细胞瘤[31]、嗜铬细胞瘤[32]、非霍奇金淋巴瘤[33]、弥漫性大B细胞淋巴瘤[34]，食管鳞状细胞癌[35]、胰腺癌[36]、前列腺癌[37]。经过对KMT2D分子在疾病发生发展中作用的不断研究，已研发出其相应抑制剂，这可能为疾病的治疗提供新的手段[7]。