正交法制备羧甲基壳聚糖－纳米银纳米微球

史梦柔 ，娄建石 ，李光远 ，郑 夺 ，陈 斌 ，高 萍 ，李毅敏

（1.天津医科大学药理学教研室，天津 300070；2.天津市医药科学研究所医用生物材料监测研究中心，天津 300020）

以羧甲基壳聚糖为载体材料的纳米给药系统已被用于经皮给药的治疗研究[1-2]。该给药系统具有控制药物释放，降低毒副作用，延长药物作用时间，减少给药次数等优点。羧甲基壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、不同程度的抗感染作用和较好的止血活性，是目前具有发展前途的天然高分子纳米粒载体材料[3]。纳米银是近年来抗菌药物的研究热点[4]，其抗菌机制独特，广谱杀菌且无耐药性，渗透性强，能够促进伤口的愈合，细胞的生长及受损细胞的修复，是最新一代的天然抗菌剂[5]。但银离子一旦游离，容易经人体创面吸收入血，通过肾脏从尿中大量排泄的同时，可以在机体的肝、肾、角膜、粘膜组织和创面上皮处沉积[6]，且其粒径小，化学性质活泼，极易发生团聚，形成带有若干弱连接界面且尺寸较大的团聚体[7]，从而影响了纳米银粒子的实际应用效果，因此不适宜直接给药。制成载药纳米微球，既可以降低其毒性，又可通过羧甲基壳聚糖成分包覆纳米银离子以防止其被氧化或团聚而失去活性[8-10]。本研究采用离子交联法制备羧甲基壳聚糖－纳米银纳米微球，探讨其制备工艺和载药性能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂 纳米银溶液（张家港耐尔纳米科技有限公司4 000 ppm），羧甲基壳聚糖（CMC，浙江澳兴生物科技有限公司，分子量30万，羧化度80%），三聚磷酸钠（TPP，分析纯），去离子水（自制）。

1.1.2 仪器 AL204电子天平（梅特勒－托利多有限公司），KQ-50E超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Model J2-21低温高速离心机，Zetasize粒径分析仪（Malvern公司），透析袋（透过 分 子 量 8 000-14 000，sigma）， 药 物 溶 出 仪（RC12A，天大天发）。

1.2 方法

1.2.1 纳米微球制备[2]以0.5%盐酸为溶剂，配制4.2、6.3和8.4 mg/mL的CMC溶液；以0.5%盐酸为溶剂，配制 2.8、3.7、4.7、5.6、6.5、7.5 和 8.4 mg/mL 的TPP溶液。离子交联法制备空白纳米微球，取一定浓度的CMC溶液20 mL，超声状态下滴入一定浓度的TPP溶液，继续超声15 min，肉眼观察并记录不同配方体系的相变状态，体系呈现乳光时为形成纳米微球混悬液。

1.2.2 纳米银溶液含量测定方法的确定

1.2.2.1 测定波长的选择：精密量取200 μL的纳米银溶液于1 000 mL棕色容量瓶中，用去离子水定容，配制成含纳米银50.00 mg/L的储备溶液，以去离子水作空白参比，利用紫外可见分光光度计，在200～900 nm范围内进行全波长扫描。

1.2.2.2 标准曲线的绘制：用移液管取储备液适量，精确配制成浓度为2.00 mg/L、4.00 mg/L、8.00 mg/L、10.00 mg/L的纳米银溶液。以去离子水为参比，在410 nm下使用可见紫外分光光度计测定其吸光度，每组平行测定3次，取3次平均值，并以浓度C对吸光度A作图。

1.2.2.3 稳定性试验：取浓度为8.00 mg/L纳米银溶液 50 mL，室温避光自然放置，于 0、2、4、6、8 h 取纳米银溶液3 mL，测量其在410 nm处的吸光度，每组平行3次。

1.2.2.4 精密度试验：按照1.2.2.2项所示方法，取浓度为4.00、6.00、8.00 mg/L的纳米银溶液3 mL，一天内重复测定5次及连续测定5 d，分别计算日内、日间变异系数。

1.2.2.5 准确度试验：随机移取一定体积的纳米银溶液，经PBS缓冲液稀释分别获得精确浓度为4.58 mg/L、7.95 mg/L和9.24 mg/L的纳米银溶液。取各浓度纳米银溶液3 mL，测定其410 nm处吸光度，每个浓度测3次。将测得的各浓度吸光度值代入回归方程，计算纳米银溶液的浓度，计算回收率。以回收率表示准确度。

1.2.3 正交试验 选择CMC溶液浓度（A），TPP溶液滴速（B），纳米银投入量（C）和空白因素（D）为 4个试验因素，TPP溶液浓度为3.1项中所选TPP溶液浓度。每个因素设3个水平，按照L9（34）正交设计（见表1），以包封率、纳米微球粒径及多分散系数作为考察指标，选出最优工艺。设定包封率的权重系数为0.4，纳米微球粒径的权重系数为0.3，多分散系数的权重系数为0.3，综合评分=［0.4X/61.67+0.3（1 000-Y）/485.9+0.3（1-Z）/0.808］×100%。将纳米银溶液加入不同浓度的20 mL CMC溶液中，避光超声10 min，待其完全溶解，超声状态下按照相应滴速滴入不同浓度的TPP溶液5 mL，继续超声10 min，各组制得的纳米微球混悬液于4℃，16 000 r/min离心10 min，取上清液，定容至25 mL，稀释50倍，按照正交试验表分别取3 mL溶液测量吸光度，代入标准曲线计算上清液中纳米银溶液浓度和包封率。

包封率=（纳米银投入量－上清液中纳米银质量）/纳米银投入量×100%。

使用粒径分析仪测量各组试验纳米微球粒径范围和多分散系数。

表1 正交因素水平表Tab 1 Table of orthogonal factors

1.2.4 纳米微球的体外释放试验 结合正交试验结果，选取综合评分最高的3组实验工艺制备出的纳米微球进行体外释放试验。将各组载药纳米微球混悬液10 mL置于处理后的透析袋内，扎牢两端，绑于溶出仪的搅拌桨上。释放条件：pH 7.4的PBS缓冲液 500 mL，37 ℃，50 r/min，在 15、30、45 min、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取样 3 mL，补充相同体积的介质。紫外分光光度法测量样品410 nm处吸光值，平行3次，计算累计释放量，绘制体外释放曲线。每组工艺选取3批样品分别进行测定，结果取平均值。

1.2.5 纳米微球体外释放拟合 选择累计释放率最高组，使用Origin 8进行拟合，计算R2。

1.2.6 纳米微球的贮存稳定性测定 取3批最优工艺制备出的纳米银纳米微球样品，避光密封贮存于4 ℃条件下，于第 0、1、7、14、30d 按照1.2.3 项中测定包封率的方法测定纳米微球离心后上清液的吸光度，代入标准曲线计算纳米银溶液浓度，以纳米银的析出量表示纳米微球的稳定性。

2 结果

2.1 纳米微球制备 选择每个配方中，体系呈现乳光时所用的最高TPP溶液的浓度，作为之后正交分析时所用的TPP溶液浓度，此时纳米微粒的交联较充分。不同配方时体系的相变状态见表2。

表2 反应体系相变状态Tab 2 Phase transition of the reaction system

2.2 纳米银溶液含量测定方法的确定

2.2.1 测定波长的选择 扫描结果见图1。显示纳米银溶液在410nm处出现一特征峰。故拟在410 nm处讨论测定纳米银浓度的可行性。

2.2.2 标准曲线的绘制 得到回归方程A＝0.1541C＋0.008，R2=0.9999，结果见图 2。显示纳米银溶液的浓度与吸光度之间存在线性关系。

2.2.3 稳定性试验 结果见表3。显示溶液在8h内稳定性良好。

图1 纳米银溶液的紫外－可见吸收光谱（20.00 mg/mL）Fig 1 UV-Vis spectra of nanosilver solutions（20.00 mg/mL）

图2 纳米银溶液标准曲线（410 nm）Fig 2 Standard curveof nanosilver solutions（410 nm）

2.2.4 精密度试验 结果见表4。日内日间精密度均符合含量测定要求。

表3 纳米银稳定性试验结果（x±s，n=3）Tab 3 Results of stability test of nanosilver

表4 纳米银精密度试验结果（x±s，n=3）Tab 4 Results of accuracy test of nanosliver（x±s，n=3）

2.2.5 准确度试验 结果见表5，显示回收率均符合含量测定要求。

表5 纳米银回收率试验结果（x±s，n=3）Tab 5 Results of recovery test of nanosliver（x±s，n=3）

2.3 正交试验 结果见表6。利用SPSS21.0对正交试验结果进行方差分析，结果见表7。

由表6可判断出在所选因素水平范围内，各因素的重要次序为A＞B＞C，即羧甲基壳聚糖溶液浓度＞滴速＞纳米银投入量。表7显示因素A有显著性影响，而因素B和C不具有显著性影响。选择A3作为最优项，可以获得包封率较高，多分散系数较小的纳米微球。选择B1作为最优项，制备的纳米微球粒径更小。综合评分显示，A3B1C2为最优工艺。

2.4 验证试验 选用最优工艺的配方重复试验3次，测得包封率分别为61.52%、60.33%和61.70%。

2.5 纳米微球的体外释放 根据正交试验结果，选取第4组、第7组、第9组工艺制备出的纳米微球进行体外释放试验，各组释放曲线见图3。如图可见第7组纳米微球综合评分最高，纳米银释放过程前2 h内释放出约50%的药量，之后释放比较平缓，8 h累计释出80%药量。与第4组和第9组比较，第7组纳米微球释药较完全。

表6 正交试验结果Tab 6 Results of orthogonal test

图3 不同制备工艺的载药纳米微球的体外释放曲线（n＝3）Fig3 Releasing curve of drug-loadednanoparticles by different preparation techniques in vitro（n＝3）

2.6 载纳米银纳米微球水凝胶体外释放拟合结果 结果见表8。可见其一级方程拟合较好。

2.7 载纳米银纳米微球贮存稳定性测定 结果见表9。载药纳米微球在4℃下放置30 d无沉淀，离心后其上清液中纳米银析出较少，结果显示其30 d内贮存稳定性良好。

表7 方差分析Tab 7 Analysis of variance

表8 载药纳米微球体外释放拟合结果Tab8 Theresultofdrug-loadednanonanoparticlesonrelevantfitting

表9 载药纳米微球稳定性结果Tab 9 The result of drug-loaded nanonanoparticles on stability

3 讨论

离子交联法是制备纳米粒的一种常用方法。此方法的反应条件温和，不使用有机溶剂，且易于得到均一、可调整粒径范围的纳米粒[12]。邹竞[13]等采用离子交联法制备了壳聚糖载吡虫啉纳米微球，考察了其载药性能。张桂贤[2]等研究了乳化交联法制备羧甲基壳聚糖-醋甲唑胺纳米微球，包封率达56%。本实验采用离子交联法制备载药纳米微球，利用无毒副作用的TPP对羧甲基壳聚糖进行离子诱导凝胶化而制备纳米粒，方法简单，工艺稳定且制得载药纳米微球包封率较高，粒径较小，分布均匀，为载银纳米微球的制备提供了最佳工艺。

本实验中使用4.2 mg/mL CMC溶液，7.5 mg/mL TPP溶液制备载药纳米微球，药物包封率高于使用其它两个浓度，可能是较高浓度的CMC溶液和较低浓度的TPP溶液在尚未交联完全时就趋向形成沉淀导致交联不完全。而此水平纳米微球分布较其它两水平更均匀，可能是由于若CMC溶液浓度过高，反应介质粘度增大，纳米银分散较差，导致在分散介质中发生团聚而使制得的纳米微球粒径增大且分布不匀。实验中控制TPP溶液的滴速在5 s/滴，制备出的载药纳米微球粒径明显小于另外两个水平，可能是减慢了TPP溶液滴入CMC溶液中的速度，使CMC与TPP交联时间充足而制得载药纳米微球的粒径更小[14]。

本研究选取了正交试验综合评分最高的3组工艺制得的纳米微球进行体外释放考察，结果显示评分最高组较其他两组释药更完全且起始释放速率较快，这可能是由于此工艺制备出的纳米微球粒径更小[15]。粒径较大的纳米微球，其核心纳米银出现团聚的现象，释放时要通过载体材料较为困难，影响了释药效果。

从释放结果可以看出该制剂存在突释现象。在前2 h释放出约50%的药量，之后会缓慢释放。这种现象也出现在其他纳米微球缓释剂中。这是由于吸附在纳米微球表面的药物率先大量释放，而包裹入纳米球中的药物要透过载体材料释放或在载体材料崩解后释放，所以释放较为缓慢平稳[16]。感染早期，充足的释药量可以迅速提高血液中药物的浓度，使血药浓度更快地达到稳态，达到抑菌效果，之后缓慢释放，可以长时间维持药物有效浓度，减少给药次数。

在贮藏条件下，纳米微球稳定性良好，30 d内纳米银从微球中基本无析出，作为载体的羧甲基壳聚糖没有出现溶解崩裂等现象，为该制剂今后的应用提供基础。

该实验证明通过离子交联法可制备出以羧甲基壳聚糖为载体，载纳米银的纳米微球，其安全性和局部抗感染作用还需进一步研究。