冬虫夏草菌粉对糖尿病大鼠对比剂肾损伤的影响

许 蔚，赵 凯，高巧营，宗春辉，高 晟

(1.天津市南开医院 心内一科，天津300100；2.天津中医药大学研究生院，天津300193；3.天津市南开医院 中西医结合急腹症研究所，天津300100)

随着冠状动脉介入诊疗技术的广泛应用和普遍发展，介入治疗逐渐成为冠心病患者主要的治疗手段，对比剂使用频率的增加促使对比剂肾病(contrast induced nephropathy，CIN)的发生率呈上升趋势，越来越受到临床医师的重视。作为三大医源性肾损害病因之一，CIN与心血管不良事件的发生率与病死率增加有关,对患者的预后造成严重的影响[1]。一旦发生CIN，目前尚无明确的治疗手段及药物,关键以预防为主。在CIN发生的相关危险因素中，研究表明，糖尿病可作为预测CIN的发生的独立危险因素[2]，冠心病合并糖尿病患者PCI术后对比剂肾病的发病率显著升高。

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌，具有补肾填精、保肺益肾、止血化痰等作用。现代药理学发现,其具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、抗细胞凋亡等作用,尤其在肾保护方面发挥重要作用[3]。但目前关于冬虫夏草预防CIN发生的研究尚不多见，且尚无相关机制研究。目前已有大量研究表明，普罗布考能够有效降低CIN的发生率及肾损伤程度，且与抗细胞凋亡有关[4,5]。本研究通过建立CIN糖尿病大鼠模型，以普罗布考作为阳性对照药物，检测药物冬虫夏草干预前后糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表达，探讨冬虫夏草对糖尿病大鼠CIN的预防作用及机制，为临床用药提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

100只健康雄性SD大鼠，8周龄，体重240-260 g，由军事医学科学院环境所动物中心提供，清洁级标准饲养(许可证号 SCXK(军)2009-003)。链脲佐菌素(购于美国Sigma公司)，碘克沙醇注射液(GE Health有限公司)，普罗布考(承德颈复康药业集团有限公司)，人工冬虫夏草菌粉(杭州中美华东制药有限公司)。尿素氮( BUN) 、肌酐( Scr) 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；NAGL检测试剂盒(上海蓝基生物有限公司)，KIM-1检 测 试 剂 盒(美国 R&D公司)；Bcl-2 抗体、Bax 抗体、caspase-3抗体(Cell Signaling公司)，蛋白核算测定仪购自Eppendorf AG公司；western Blot电泳设备、凝胶成像系统均购于Bio-Rad公司；病理包埋机、切片机(LEICA公司)；LEICA DM4000B正置显微镜购自德国leica公司。

1.2 模型制备及分组方法

100只雄性SD大鼠适应性喂养一周，造模前检测大鼠尾静脉血糖，均显示在正常范围。大鼠禁食 12 h称重，经腹腔按60 mg/kg 剂量注射链脲佐菌素(STZ)，注射72 h及1周后断尾测血糖，以非禁食随机血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型构建成功。成模大鼠84只，随机分为对照组(N组)，对比剂肾病组(M组)，冬虫夏草干预组(C组)，普罗布考干预组(P组，阳性对照组)4组，每组21只。

1.3 CIN模型建立及取材

根据高巧营[6]报道的CIN 造模及用药方法，糖尿病造模后饲养 9 周后，C组给予冬虫夏草剂量(3 g/kg/d) 用双蒸水配制成浓度 0.2 g/mL的悬液，灌胃处理，P组给予普罗布考 (500 mg/kg) 灌胃，正常对照组(N组)、对比剂肾病组(M组)给予等量生理盐水灌胃，连续 6 d; 第 7 天时禁水不禁食。第8天，经尾静脉注射碘克沙醇注射液(2.0 g iodine/kg)制备CIN模型,以Scr比对照组升高(>25%)判定CIN的模型是否成功。于注射对比剂前及注射24 h后，收集尿液。于注射对比剂前，各组大鼠鼠尾静脉采血2 ml，离心留取上清液；注射对比剂24 h后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，开腹取下腔静脉血2 ml，离心留取上清液，采用脲酶法测定BUN，苦味酸法测定 Scr。大鼠取血后称重，开腹后采集左右肾脏，留取肾组织。左肾剖开部分固定于福尔马林，以备肾脏病理研究；部分-80℃冻存，用于检测指标；右肾-80℃冻存，用于Western blotting蛋白定量分析。

1.4 相关指标检测

1.4.1肾功能及损伤指标检测

脲酶法测定血清尿素氮(BUN)；苦味酸法测定血清肌酐(Scr)；ELISA 法检测尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤因子-1(KIM-1)，按照试剂盒说明书利用半自动生化仪测定。

1.4.2肾脏组织病理观察

肾组织常规脱水石蜡包埋，切片后进行梯度酒精脱水、透明、HE染色，于正置显微镜下观察肾脏组织病理变化。

1.4.3肾组织 Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表达

提取肾组织总蛋白、SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、封闭、抗原抗体反应、放射自显影，检测肾组织Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组肾功能相关指标比较

对比剂肾病组(M组)BUN、Scr均高于正常对照组(N组)(P均<0.01)。普罗布考干预组(P组)BUN、Scr均低于M组(P均<0.05)；冬虫夏草干预组(C组)BUN、Scr均低于M组(P均<0.01)。与N组比较，M组大鼠NGAL、KIM-1含量均明显升高(P均<0.01)；与M组比较，P和C组NGAL含量均明显减低(P均<0．01)；P组KIM-1含量减低(P<0.05)，C组KIM-1含量减低(P<0.01)。C组与P组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组糖尿病大鼠肾功能指标比较

注：BUN:尿素氮；Scr:血肌酐;。NAGL:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；KIM-1:肾损伤因子-1(N组对照组；M组对比剂肾病组；P组普罗布考干预组；C组冬虫夏草干预组； 与N组比较，*P<0.05,**P<0.01；与M组比较，&P<0.05,&&P<0.01。

2.2 肾脏病理改变

2.2.1各组大鼠HE染色肾小球、肾小管损伤程度检测

各组大鼠肾组织的HE染色结果，N组大鼠肾小球、肾小管及间质未见病变。M组肾小球基底膜增厚，近曲小管肿胀，胞浆嗜酸性、细颗粒状，结构不清，远曲小管萎缩，胞浆透明变性。C组及P组两张病理图片形态相似，肾小球基底膜无明显增厚，近曲小管及远曲小管结构清晰。见图1。

图1 肾组织形态结构的比较(HE染色,X200)

2.2.2各组大鼠肾小球、肾小管损伤电镜检查结果

N组大鼠肾小球、肾小管细胞未见明显损伤；M组大鼠肾小球血管袢基底膜部分性增厚，并有细密的颗粒物沉积，基膜近系膜侧明显增厚，部分足突融合。肾小管上皮细胞包浆可见多量空泡，粗面内质网轻度肿胀脱颗粒。线粒体严重肿胀，嵴断裂部分消失。肾小管腔面微绒毛大量脱落，基底膜严重增厚；C组大鼠肾小球血管袢基底膜大部分厚度均匀，有局灶性增厚。大部分血管内皮窗孔均匀分布，足突分布均匀，极少量融合； P组大鼠肾小球血管袢基底膜厚度基本均匀，血管内皮穿孔分布均匀，足突裂隙均匀分布。肾小管上皮细胞胞质内可见少量溶酶体，部分线粒体排列轻度紊乱，肾小管基底膜厚度基本正常。见图2。

图2 肾组织形态结构的比较(电镜检查,X10 000)

2.3 各组肾组织 Bax、Bcl-2 ，caspase-3、caspase-9表达比较

与正常对照组(N组)比较，对比剂肾病组(M组)肾脏Bax、caspase-3表达升高，Bcl-2 表达及Bcl-2 /Bax均降低(P均<0.05)。与M组比较，C组、P组大鼠Bax、caspase-3表达水平降低，Bcl-2表达及Bcl-2 /Bax均升高(P均<0.05) 。C组与P组比较差异无统计学意义(P均>0.05) 。见图3。

图3 各组Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达

3 讨论

CIN定义为排除其他肾脏损害因素情况下,静脉或动脉内使用对比剂后72 h(3 d) 内出现的肾损害：血肌酐较基础值升高>25%或者绝对值升高≥44.2 μmol/L[7]。研究显示，PCI术后CIN患者住院死亡率高达22%，其1 年及5 年死亡率为12.1%和44.6%，较非CIN患者明显升高[8]。糖尿病不仅是冠心病的高危因素，也是CIN发生的重要危险因素之一[9]；对CIN进行早期诊断和干预，对患者的预后具有十分重要的意义。血肌酐虽作为CIN的诊断标准，但其敏感性低，其变化相对于早期肾损伤较为滞后，且受多种因素的影响；故近年来的研究表明，NGAL[10]、KIM-1[11]等早期肾损伤标记物对CIN有重要的预测价值，且与肾损伤程度呈正相关[12]。

目前，对CIN的防治措施比较公认的是水化治疗，尚无确切药物，近年来研究表明，他汀类、普罗布考、前列地尔等药物能减轻CIN的肾损害程度[13，14]。而中医药治未病的辨证思想为防治CIN提供了新的思路。中医认为“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”，患者素有正气不足，感受对比剂所致的外来毒邪，进一步损伤正气，产生湿、瘀等病理产物，影响三焦水道通调，津液失于输布，发为CIN，为本虚标实之证[15]。肾为先天之本，气血阴阳之源，肺主宣发肃降，为一身宗气之本，对三焦气化、水液代谢发生至关重要的作用。冬虫夏草性甘温，归肺、肾二经，可保肺补肾、益气生津，通调水道，发挥肾保护作用。赵凯[16，17]等研究表明，冬虫夏草制剂可预防冠心病心绞痛患者CIN的发生，对2型糖尿病肾功能不全患者具有改善CIN早期肾损伤的作用,且强化治疗更有效。本实验研究显示，与对照组(N组)相比，其余各组的Scr 、BUN 及NGAL、KIM-1数值均明显升高；与对比剂肾病模型组(M组)相比，冬虫夏草干预组(C组)和普罗布考干预组组(P组)的Scr 、BUN 及NGAL、KIM-1数值均明显下降，说明使用对比剂之前应用冬虫夏草干预具有改善CIN肾损伤的作用，与临床研究结果一致。病理结果亦显示C组和P组均较M组肾小球肾小管细胞损伤有所改善。因目前已有大量临床及实验研究表明，普罗布考能够有效降低CIN的发生率及肾损伤程度，故本实验以普罗布考为阳性对照药，结果表明冬虫夏草的肾保护作用与普罗布考相当。

对比剂肾病的发病机制目前尚未完全阐明，可能与肾血流动力学改变、肾小管上皮细胞的毒性损害、氧化应激损伤、细胞凋亡、肾小管阻塞等机制有关[18]。研究发现，CIN的发生与造影剂的直接肾毒性及促进细胞凋亡有关，可降低Bcl-2表达及 Bcl-2/Bax，促进糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡[19]。在细胞凋亡家族成员中，Bcl-2蛋白广泛地定位于细胞内的线粒体、核膜和内质网膜内，在凋亡过程中发挥着抗凋亡作用，从而延长细胞的寿命，故被称之为“长寿基因”。线粒体外膜上的抗凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax，在线粒体通透性转换孔的开放和关闭过程中起到关键的调控作用。对比剂可以引起肾小管细胞的线粒体损伤，线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，从而上调促凋亡基因 Bax m RNA 的表达，并下调抑凋亡基因 Bcl-2 m RNA 表达，导致细胞的凋亡[20]。既往研究表明，普罗布考及冬虫夏草均具有抗细胞凋亡的作用[21]。本实验研究结果显示，与对照组(N组)比较，对比剂肾病组(M组)肾脏Bax、caspase-3表达升高，Bcl-2及Bcl-2 /Bax 表达降低(P均<0.05)。与对比剂肾病组(M组)比较，冬虫夏草干预组(C组)、普罗布考干预组组(P组)大鼠Bax、caspase-3表达水平降低，Bcl-2表达及Bcl-2/Bax升高(P均<0.05) 。提示冬虫夏草具有减轻糖尿病CIN大鼠肾细胞凋亡的作用。

综上所述，冬虫夏草可下调Bax、caspase-3 表达，上调Bcl-2表达及Bcl-2 /Bax，抗细胞凋亡，发挥对CIN的肾保护作用。