环介导等温扩增技术在肺结核病诊断中的应用评价

杨 健，张天华，鲜小萍，李 妍，陈美玲，王 蕊

(陕西省结核病防治研究所，陕西 西安710048)

结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病，目前，我国菌阴肺结核(3次涂片和1次培养均为阴性的活动性肺结核)约占所有肺结核患者的70%[1]，该病的诊断一直困扰着广大临床医生。结核病实验室检查为结核病的确诊提供了重要病原学证据，也是确定传染性肺结核尤其是耐多药肺结核病的重要依据[2]。传统痰涂片染色镜检法敏感度较低，培养法耗时较长，均难以实现对结核病患者的早期正确诊断。环介导等温扩增技术通过特异引物与结核分枝杆菌的gyrB基因结合，在恒温条件下进行扩增[3]，具有特异性高、时间短、操作简单等优点，初步应用于全国各级结核病实验室，我省于2016年引进此项技术用于结核病的诊断，而目前在我省尚缺乏应用LAMP诊断肺结核病的评价报道，笔者采用痰涂片镜检法、固体培养法、LAMP同时对258例研究对象的同一份痰标本进行检测，以临床诊断结果为标准，评价LAMP对肺结核病的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月-2018年3月在陕西省结核病防治研究所和陕西省汉中市第二人民医院就诊的258例肺结核可疑症状者作为研究对象，根据肺结核诊断标准(WS288—2017)[4]将研究对象分为肺结核病组和非肺结核病组。肺结核病组176例，包括136例临床确诊病例和40例临床诊断病例；非肺结核病组82例。

1.2 检测方法

同时应用痰涂片镜检法、固体培养法、LAMP对258例研究对象的同一份痰标本进行检测。其中痰涂片采用直接涂片法进行金胺O荧光染色，罗氏固体培养采用简单法，罗氏培养基及染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，环介导等温扩增检测采用广州迪奥生物科技有限公司的仪器和试剂。各项实验操作均按照《结核病诊断实验室检验规程》[5]中的标准化操作程序进行，如果试验失败均进行二次检测。

环介导等温扩增检测：在<5 ml痰液中加入1-2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋震荡30秒，室温静置15分钟，使其充分液化，取1 ml液化后痰液至1.5 ml离心管，13 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用1 ml无菌生理盐水(0.9% NaCl)悬浮，同上离心条件洗涤2次。弃上清液，保留沉淀物。向含沉淀物的离心管中加入40 μl核酸提取液，震荡混匀，沸水浴(95-100℃)10 min，然后冷却至室温；13 000 r/min离心5分钟，上清液做为模板备用。吸取23 μl聚合酶和20 μl密封液至0.2 ml反应管中，依据所需检测样本数量准备反应体系数目，每次检测均设置阳性对照和阴性对照。将制备的模板以及阴阳性对照加入反应体系。将反应管置于恒温扩增荧光检测仪上进行反应，由仪器自动判读结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，以临床诊断结果为标准，比较痰涂片镜检法、固体培养法和LAMP检测MTB的效能；在痰涂片阴性患者中，比较固体培养法和LAMP检测MTB的效能；在涂阴培阴患者中，评估LAMP检测MTB的效能。计算LAMP检测技术的敏感度(sensitivity,Se)、特异度(specificity,Sp)。组间率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。各检测方法与临床诊断结果的一致性评价采用Kappa检验，K≤0.40时，两者一致性较差；0.40

2 结果

2.1 3种方法对结核分枝杆菌的阳性检出率比较

在258例研究对象中，LAMP的阳性检出率51.55%(133/258)显著高于痰涂片镜检法31.40%(81/258)、固体培养法39.92%(103/258)，差异均有统计学意义(χ2=21.59，P<0.001；χ2=7.03，P=0.01)。在127例黏液痰标本中，LAMP的阳性检出率54.33%(69/127)显著高于痰涂片镜检法40.94%(52/127)，差异有统计学意义(χ2=4.56，P=0.03)；在唾液痰标本中，LAMP的阳性检出率34.61%(27/78)显著高于痰涂片镜检法12.82%(10/78)和固体培养法19.23%(15/78)，差异均有统计学意义(χ2=10.24，P=0.001；χ2=4.69，P=0.03)；LAMP在唾液痰标本中的阳性检出率34.61%(27/78)显著低于在干酪痰73.91%(34/46)和黏液痰54.33%(69/127)中的阳性检出率，差异均有统计学意义(χ2=17.88，P<0.001；χ2=7.54，P=0.01)。见表1。

表1 痰涂片镜检、固体培养、LAMP在不同性状痰标本中检测MTB的结果比较

2.2 3种方法的检测效能评价

以临床诊断为标准，LAMP的敏感度73.30%(129/176)显著高于痰涂片镜检法46.02%(81/176)和固体培养法58.52%(103/176)的敏感度，差异均有统计学意义(χ2=25.98，P<0.001；χ2=8.55，P=0.003)，见表2。

表2 以临床诊断为标准，三种方法检测MTB的效能比较

2.2 固体培养法和LAMP 在涂阴患者中检测MTB的效能比较

在177例涂阴患者中，固体培养法和LAMP的阳性检出率分别为18.08%(32/177)、30.51%(54/177),差异有统计学意义(χ2=7.43,P=0.01)。以临床诊断结果为标准，LAMP的敏感度52.63%(50/95)显著高于固体培养法的敏感度33.68%(32/95)，差异有统计学意义(χ2=6.95，P=0.01)，见表3。

表3 固体培养法和LAMP 在痰涂阴患者中检测MTB的效能比较

2.3 LAMP 在涂阴培阴患者中检测MTB的效能评价

在145例涂阴培阴患者中，LAMP的阳性检出率为20.00%(29/145)。以临床诊断结果为标准，LAMP检测MTB的敏感度和特异度分别为39.68%(25/63)、95.12%(78/82)，见表4。

表4 LAMP 在涂阴培阴患者中检测MTB的效能

3 讨论

目前，涂片法和培养法依然是大多数结核病高发国家的结核病实验室的主要病原学检测方法，已不能满足临床诊疗的时效需求，随着对结核分枝杆菌全基因组的解析，通过检测结核分枝杆菌核酸进行快速诊断的技术也应运而生，LAMP作为一种快速分子检测方法初步应用于我省各级结核病实验室，这对于提高我省的肺结核患者病原学阳性率具有重要意义。

本研究结果显示：LAMP的阳性检出率(51.55%)明显高于痰涂片镜检法(31.40%)和固体培养法(39.92%)。这与于霞等[6]报道的研究结果一致。在唾液痰标本中LAMP的阳性率(34.61%)显著高于痰涂片镜检法(12.82%)和固体培养法(19.23%)。涂片法是从形态学角度进行鉴别，而结核分枝杆菌因个体发育和环境适应等因素影响，存在形态多样性，出现球状、短杆状、丝状、细胞壁缺陷的L型等形态，痰涂片镜检法主要是以典型的杆状形态为病原学报告依据的，且主要依赖于检验人员的识别能力，故可能出现假阴性的情况，敏感度较低。固体培养法在应用酸、碱进行前处理时，也会损伤标本中50%-80%的结核菌活性，降低阳性检出率[7]。LAMP在恒温条件下进行扩增反应，与传统PCR技术相比无需进行变性、退火、延伸等复杂过程，缩短了检测时间；同时减少DNA大片段聚合酶与扩增核酸的污染机会，此外，LAMP只有在4条引物完全识别靶序列6个结合区的情况下才能顺利进行，减少了非特异性的影响。

在唾液痰标本中的阳性检出率(34.61%)显著低于在干酪痰(73.91%)和黏液痰(54.33%)中的阳性检出率。唾液痰标本并不是从肺深部咳出，含菌量较少，其在玻片上粘附力也较差，在涂片、染色过程中，会造成待检成分的大量丢失，导致涂片法、固体培养法检出率降低，这也提醒医务人员应加强对患者的留痰宣教，指导患者留取合格的痰标本以提高阳性检出率。有研究表明LAMP在血痰标本中的阳性检出率低于传统涂片法和培养法，原因可能与血液成分中含有血红蛋白等抑制PCR反应，造成阳性检出率降低[8]，本研究在血痰中3种方法阳性检出率相同，可能由于血痰样本量较少，仅有7例，无法判别差异。

以临床诊断为标准时，LAMP诊断肺结核病的敏感度(73.30%)显著高于痰涂片镜检法(46.02%)和固体培养法(58.52%)，提示LAMP的临床应用价值高于痰涂片镜检法和固体培养法。本研究LAMP诊断肺结核病的敏感度(73.30%)高于欧喜超[8]报道LAMP的敏感度(49.44%)和李金莉[9]报道LAMP的敏感度(52.7%)，可能由于选择临床诊断标准版本不同所致，本研究依据2017年的最新版肺结核诊断标准(WS288-2017)对患者进行诊断分类，与之前的肺结核诊断标准(WS288-2008)相比，肺结核确诊病例条件增加了分子生物学检查结果，故提高了LAMP检测的敏感度。

近来国内多项研究均以固体培养为金标准对LAMP进行评价，有研究表明：LAMP对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的检出限达到10 CFU/mL[10]，远高于痰涂片镜检法(5000-10000菌/mL)和固体培养法(100菌/mL)以上的检出限，在一定程度上说明，涂片和培养均为阴性并不代表痰标本中没有结核分枝杆菌，是由于细菌数量低于检出限造成的。LAMP对菌阴肺结核的检出有可能影响结果的评判。本研究以临床诊断为标准，在涂阴患者中，LAMP的敏感度(52.63%)显著高于固体培养法的敏感度(32.63%)，LAMP与临床诊断结果相比具有中度一致性(Kappa=0.46)；在涂阴培阴患者中，LAMP检测MTB的敏感度和特异度分别为39.68%、95.12%，与临床诊断结果相比一致性较差(Kappa=0.37)；LAMP在涂阴患者中的阳性检出率为30.51%，在涂阴培阴患者中的阳性检出率为20.00%，与国内报道[11]LAMP对涂阴或培阴标本的阳性检出率在20%-30%的结果相一致，以上数据提示LAMP对于检测涂阴肺结核患者具有一定的技术优势。

因分子生物学方法存在一定的假阳性，应将LAMP与痰涂片镜检法和固体培养法有效联合起来，以避免假阳性的发生，降低误诊率。