果树根部土壤中乳酸菌群的分离和生理生化特征研究

2018-12-25王拥军

焦作大学学报 2018年4期

张蓓王拥军

（焦作大学化工与环境工程学院，河南焦作454003）

在果树根部的土壤中，有各种各样的有益的微生物，例如光合细菌、乳酸菌、酵母、放线菌等等。这些微生物能够使果树根部更加健康、强壮，有的微生物能增加果树的产量、提高水果的质量。特别是乳酸菌，产生的乳酸有很强的杀菌能力。而且，它还能把一些难分解的有机物转化成易分解的、容易被植物根部吸收的营养物质。尽管乳酸菌对果树的生长起到很多有益的作用，然而，从土壤资源中分离乳酸菌的研究很少。

众所周知，乳酸菌的生长需要丰富的营养，糖类、矿物质、氮化合物和其他的一些物质是乳酸菌生长所必须的。然而，同其他环境条件相比，土壤中的营养是比较少的。但是由于水果中含有大量的糖分，所以我们就考虑由于跌落的果子，果树根部的土壤中，乳酸菌生长所必须的营养成分应该比其他土壤环境丰富。

本研究旨在对河南省部分地区果树根部土壤中的乳酸菌进行分离，并对分离到的乳酸菌进行生理生化研究。

1.材料和方法

1.1 土壤样品

从河南省不同的果树根部（柿树、桃树、葡萄树、草莓、石榴树、枣树、核桃树、樱桃树、无花果树、杏树）收集到12个土壤样品，收集时间是2017年9月份。样品收集后装进无菌的袋子里，-20℃保存待分析。

1.2 菌株的分离与保存

将10g样品加入到90ml无菌水中，用震荡器震荡60s，使其充分混合，然后将其用无菌水从10-1～10-5梯度稀释，取 10-1，10-3和 10-5倍稀释液各10μL分别涂布于含有MRS肉汤琼脂、Blue Light Broth琼脂、Potato Dextrose琼脂、Nutrient琼脂的培养基；取10-1和10-2倍稀释液各 1ml，在70℃水浴锅中加热20分钟后，取 10μL涂布于Nutrient琼脂培养基，30℃静置培养48小时。其中，MRS肉汤琼脂培养基在厌氧箱30°C厌氧培养48小时，其他培养基均在好气恒温培养箱30°C培养48小时。对所有培养基上的菌落用平板计数法进行计数。乳酸菌的计数在MRS培养基上进行，大肠杆菌的计数在BLB培养基上进行、霉菌和酵母通过观察菌落形态，在PDA培养基上进行区分后分别计数。芽孢杆菌和好氧性细菌在NA培养基上进行计数。乳酸菌依据菌落的大小、形态和颜色，挑取单菌落并纯化2次后-80℃保存于1mL加10%二甲基亚砜（DMSO）的Nutrient肉汤培养基中。

1.3 菌株生理生化特征分析

对分离的乳酸菌进行过氧化氢酶实验、革兰氏染色。乳酸菌盐耐受性的测定分别在含有3.0%和 6.5%（w/v）NaCl的液体 MRS培养基（pH6.5）中进行，30℃下培养48小时后和未接种的对照管对比，记录结果。分别在pH为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,9.0的液体 MRS培养基（pH6.5）中测试乳酸菌在不同pH下的生长情况，30℃下培养7天，与未接种的对照管对比，观察记录结果。在液体MRS培养基（pH6.5）中测试乳酸菌分离株在不同温度范围内的生长情况，分别在 5℃，10℃，45℃，50℃条件下培养，其中45℃和 50℃下培养 7天，5℃，10℃培养14天，与未接种的对照管对比，观察记录结果。

2.结果

2.1 微生物计数

土壤中可见微生物的数量见表1。总的来说，这12个土壤样品中乳酸菌的数量在105～106之间，好氧性细菌的数量在106～107之间,霉菌的数量在 0～106之间，酵母的数量在 105～108之间，芽孢杆菌在 104～108之间。

表1 样品微生物分析

9 5.5×105 1.0×105 5.5×105 1.0×105 1.05×106 10 3.0×105 1.5×106 2.4×106 5.5×105 1.6×106 11 1.0×105 1.0×105 4.4×106 - 2.75×106 12 4.0×105 2.0×105 1.05×106 2.0×105 9.0×105

2.2 生理生化特征

按照生理生化特点，选出了部分代表菌株，其生理生化特征见表2。菌株都是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的球菌。他们都能够在pH 3.0～9.0,10°C和40°C,3.0%和 6.5%的 NaCl条件下生存。菌株GS1-1,GS1-2,GS6-4,GS17-2,GS19-1,GS19-2,GS20-2,GS20-5不能在50°C下生长。所有的菌株在5°C条件下不生长或者长势比较弱。