蜘蛛香胶囊中橙皮苷的TLC鉴别和HPLC测定

李艳艳，李锋涛，金礼琴，陈 毓，吉钰萍，吴 悦，杨海峰，乔秋萍，卜仕金，李勇军*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；3.江苏中牧倍康药业有限公司，江苏泰州 225300)

蜘蛛香为败酱科植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根茎和根，又名马蹄香，收载于2015年版《中国兽药典》，性味辛、苦、温，具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿的功效，主治肚腹胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛[1-3]。蜘蛛香主要含有挥发油、黄酮类、环烯醚萜类和多糖等化学成分[4]。现代药理学研究表明，蜘蛛香提取物不仅具有镇静、催眠、镇痛、双向调节肠道蠕动等作用[5-7]，对革兰阳性菌、轮状病毒及非轮状病毒引起的肠炎也具有较好的疗效[8-9]。蜘蛛香含药血清能够增强小鼠脾淋巴细胞转化能力，提高腹腔巨噬细胞能量代谢水平和吞噬能力，具有一定的免疫增强作用[10]。

细小病毒性肠炎是一种犬和猫的急性高度接触性传染性肠炎，主要临床症状为呕吐和腹泻，临床大多采用“高免血清+单抗+对症疗法+支持疗法”的综合措施，治疗成本较高。针对宠物临床用药需求，课题组以蜘蛛香药材为原料研制了国家三类新兽药蜘蛛香胶囊([2017]新兽药证字02号)。该制剂具有行气止痛、健脾止泻的功效，主治犬细小病毒性肠炎。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要化学成分之一，含量高，稳定性好。本试验对蜘蛛香胶囊中的橙皮苷进行薄层色谱(TLC)鉴别和高效液相色谱(HPLC)含量测定，为蜘蛛香胶囊的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 LC20A型高效液相色谱仪，配备SPD-20A紫外检测器、LC-20AT双泵、HT-220A柱温箱，日本岛津公司产品；UV-2250型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；AS1201型自动进样器，大连依利特公司产品；BT25S型电子天平，北京赛多利斯公司产品。

1.1.2 药物和试剂 蜘蛛香胶囊，规格0.25 g/粒，批号分别为150826、150828、150830、150906、150908、150910，江苏中牧倍康药业有限公司生产；橙皮苷对照品，批号110721-201316，购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为自制纯化水，其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 TLC鉴别

1.2.1.1 供试液的制备 取蜘蛛香胶囊内容物0.3 g，加甲醇20 mL加热回流20 min，滤过。取滤液10 mL，浓缩至2 mL，即得。

1.2.1.2 对照药材溶液的制备 另取蜘蛛香对照药材0.3 g，按“1.2.1.1”方法制成对照药材溶液。

1.2.1.3 对照溶液的制备 再取橙皮苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作为对照品溶液。

1.2.1.4 薄层鉴别 吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一用5 g/L氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)为展开剂，展至约3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上层溶液为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.2 HPLC含量测定

1.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为40 μg/mL的溶液。

1.2.2.2 供试品溶液制备 取蜘蛛香胶囊内容物，研细，分别取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2.3 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；流速：1.0 mL/min，检测波长：284 nm，柱温：30℃，进样量：20 μL。

1.2.2.4 线性关系考察 精密称取橙皮苷对照品20 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液0.5、1、2、5、10、20 mL，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成8、16、32、80、160、320 μg/mL系列浓度的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液20 μL，分别进样，测定峰面积。以橙皮苷进样量x(μg)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.5 精密度试验 精密吸取同一浓度的橙皮苷对照品溶液20 μL，按“1.2.2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算RSD。

1.2.2.6 稳定性试验 取蜘蛛香胶囊内容物0.5 g，精密称定，按“1.2.2.2”项下制备供试品溶液，分别于配制后0、1、3、6、12、24 h，按“1.4.3”项下色谱条件进样测定，测定峰面积，计算RSD。

1.2.2.7 重复性试验 取同一批号的蜘蛛香胶囊内容物6份，每份约0.5 g(精密称量)，按“1.2.2.2”的方法制备供试品溶液，并按“1.2.2.3”项下色谱条件进样测定，计算RSD。

1.2.2.8 加样回收率试验 取同一批号已知橙皮苷含量的蜘蛛香胶囊内容物6份，每份约0.5 g，精密称定，每份分别精密加入橙皮苷对照品溶液20 mL(0.2005 mg/mL)，按“1.2.2.2”制备供试品溶液，并按“1.2.2.3”色谱条件进样测定。

1.2.2.9 样品含量测定 取不同批次的蜘蛛香胶囊内容物，每批取3份，每份约0.5 g(精密称量)，按“1.2.2.2”制备供试品溶液，并按“1.2.2.3”色谱条件进样测定，测得峰面积，用外标法计算出橙皮苷含量，并换算成每粒蜘蛛香胶囊中所含的橙皮苷含量。

2 结果

2.1 TLC鉴别

TLC色谱图见图1，可见斑点清晰，显色效果好，供试品色谱在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明TLC能鉴别出橙皮苷。

1.橙皮苷对照品(Hesperidin reference) 2.蜘蛛香对照药材(Valerianajatamansireference)3.蜘蛛香胶囊供试品(Tested sample ofValerianajatamansicapsule)

图1橙皮苷的薄层色谱图

Fig.1 The TLC chromatogram of hesperidin

2.2 HPLC含量测定

2.2.1 色谱行为 HPLC色谱图见图2，在上述色谱条件下，橙皮苷与供试品溶液中的其他组分分离度良好，其保留时间在14.6 min左右，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于3 000。

2.2.2 标准曲线 橙皮苷标准曲线见图1，回归方程y=1 906 206.20x+102 959.48，相关系数r=0.999 9，橙皮苷进样量在0.16 μg～6.4 μg范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.2.3 精密度 同一浓度(32 μg/mL)的橙皮苷对照品溶液峰面积的RSD为0.43%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性 测得同一批次(批号150826)蜘蛛香胶囊中橙皮苷的平均含量为2.11 mg/粒，RSD为1.9%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性 同一供试品溶液(批号150826)在制备后24 h内，不同时间点所测得的橙皮苷峰面积的RSD为1.7%(n=6)，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率 加样回收率试验结果见表1，橙皮苷的平均回收率为97.7%，RSD为1.3%(n=6)，表明该方法准确性良好。

1.橙皮苷； A.橙皮苷对照品； B.蜘蛛香胶囊供试品 1.Hesperidin；A.Reference of hesperidin； B.Tested sample of Valeriana jatamansi capsule

图3 橙皮苷标准曲线

2.2.6 样品含量测定 6批次蜘蛛香胶囊橙皮苷含量测定结果见表2，橙皮苷平均含量为2.08 mg/粒。

3 讨论

安全、有效、质量可控是对兽药开发和生产的基本要求，而质量标准研究是兽药质量可控的必需过程。近年来，在中兽药的质量标准研究中，采用TLC和HPLC法测定中兽药的主要成分，已有大量文献报道，并因其快速、灵敏、高效、准确等特点而被广泛应用[11]。新兽药蜘蛛香胶囊为单方硬胶囊剂，蜘蛛香药材中含有橙皮苷，本研究分别采用TLC和HPLC法对蜘蛛香胶囊中的橙皮苷进行了定性和定量分析。

表1 蜘蛛香胶囊中橙皮苷的加样回收率试验

本试验参照2010年版《中国兽药典》(二部)陈皮中橙皮苷的薄层色谱条件，对蜘蛛香胶囊中的橙皮苷进行了定性鉴别，获得的薄层色谱图斑点清晰，显色效果好，表明橙皮苷的TLC法鉴别可以作为制定蜘蛛香胶囊质量标准的依据。参考文献报道的蜘蛛香药材中橙皮苷HPLC检测方法[12-14]，本试验分别选择了乙腈1 mL/L磷酸溶液(15∶80)、乙腈∶水(15∶85)、甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)、乙腈20 mL/L醋酸溶液(18∶82)等几种不同组成及不同比例的流动相进行了考察，结果显示以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)作为流动相获得的色谱峰峰形较好，橙皮苷的分离效果最好。同时还试验了不同生产厂家的色谱柱，如Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Platisil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18MG (S-5)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Grace Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)等，各个色谱柱的峰形均较好，橙皮苷也能较好分离，理论板数按橙皮苷峰计算都高于3 000。表明所建立的HPLC方法系统适应性较好，灵敏度高。

6个不同批次的蜘蛛香胶囊中橙皮苷(C28H34O15)的平均含量为2.08 mg/粒，考虑不同产地蜘蛛香药材中橙皮苷含量的差异，以含量测定值的80%作为含量下限，本品每粒含蜘蛛香以橙皮苷(C28H34O15)计，不得少于1.66 mg。表明采用TLC和HPLC法对蜘蛛香胶囊中的橙皮苷进行定性和定量分析，具有准确、简便、重复性好等特点，可用于该中兽药的质量控制。

表2 蜘蛛香胶囊中橙皮苷的含量测定结果(mg/粒)