从江香猪源干扰素α2基因的克隆与序列分析

温贵兰，陈绍品，张升波，林汉卿，赵德刚

(1.贵州大学农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院 预防兽医实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州省农业科学院，贵州贵阳 550006)

贵州从江香猪主产于贵州省黔东南苗族侗族自治州从江县，具有小、香、纯、净的特点。其优良的品质，具有较高的科研与经济价值[1-3]。干扰素(interferon,IFN)是1957年英国科学家Isaacs A等用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物[4]。按结构和来源的不同，干扰素分为Ⅰ型(IFN-α和IFN-β)、Ⅱ型(IFN-γ)和Ⅲ型(IFN-λ)，3种类型的干扰素具有相似的功能，即抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫力[5]。猪干扰素(porcine interferon PoIFN)分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型干扰素包括α、β、ω、δ等多个亚型[6-7]。猪α干扰素由猪白细胞产生，约17个基因拷贝分布于I号染色体上，翻译出至少20多个IFN-α亚型[8]。猪干扰素IFN-α作为一种高效的抗病毒细胞因子，对猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒等多种病毒具有抑制作用[9-14]。Sang Y等在Marc-145与PAM细胞上分析了14种干扰素α亚型(α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、α12、α13、α14)、11种IFN-δ亚型，7种IFN-ω亚型，1种IFN-αω以及IFN-β、IFN-ε、IFN-κ亚型对PRRSV的保护效果，研究结果表明IFN-α2在Marc-145与PAM细胞上均表现出最理想的抗病毒活性[15]。

随着我国养猪业快速发展，疾病的威胁也随之增加，尤其是猪病毒性疾病严重制约着行业的持续发展，干扰素制剂作为一种新型生物制剂，在疾病预防和控制方面发挥着重要的作用。本文选取我国珍稀物种从江香猪作为研究对象，提取从江香猪肝脏组织RNA,经反转录，特异性引物扩增从江香猪的IFN-α2(CJ-poIFN-α2)编码区，对CJ-poIFN-α2序列进行分子生物信息学分析，为后期进一步研究干扰素的生物学活性，加快从江香猪的资源开发与利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州从江香猪源肝脏组织由贵州大学动物科学学院张勇副教授惠赠；pUCm-T载体、DH5α菌株购自碧云天生物技术研究所；反转录酶、dNTP、RNA抑制剂等试剂购自Promega公司产品；RNA提取试剂盒、SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DEPC购自AMRESCO公司；Solution I、DL 5 000 Marker购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据参考文献[16]与NCBI网站提供的猪源IFN-α2序列，用DNA Star软件设计合成相应引物。引物序列为poIFN-α2-F：5′-ATGGCCCCAACCTCAGCCTTCC-3′；poIFN-α2-R：5′-TCACAGGTTTCTGGAGGAAGAG-3′，预扩增片段大小为546 bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 RNA提取与cDNA合成 按生工生物工程(上海)股份有限公司试剂盒说明书操作步骤，提取从江香猪肝脏组织总RNA，逆转录合成cDNA。逆转录体系为：RNA 8 μL，Oligo(dT) 2 μL，总体系10 μL，70℃的水浴作用5 min，取出置于0℃的冰上；再加入如下体系：5×buffer 6 μL，RNasin 1 μL，dNTP 2 μL，MLV 1 μL，H2O 10 μL，将上述总体系30 μL的溶液置于42℃的水浴锅，反转录作用1 h，75℃灭活15 min即逆转录成cDNA。

1.2.3 从江香猪源IFN-α2基因PCR扩增 以反转录生成的cDNA为模板，用IFN-α基因引物poIFN-α2-F、poIFN-α2-R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为：poIFN-α2-F、poIFN-α2-R引物各0.5 μL，dNTP(25 mm each)2.5 μL，2×G+C buffer 10 μL，Primestar酶0.5 μL，cDNA 2 μl，H2O 4 μL。扩增参数：94℃ 3 min；94℃ 5 s，58℃ 10 s，72℃ 50 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 重组质粒pUCm-CJpoIFN-α2的构建 PCR产物采用生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式PCR纯化试剂盒进行纯化，纯化后PCR产物与pUCm-T载体进行连接。连接体系为：PCR产物4.5 μL，Solution I 5 μL，pUCm-T载体0.5 μL，16℃连接1 h。连接产物转化至感受态细胞DH5α中，涂板于含氨苄抗性的平板上培养14 h～16 h，挑选单个菌落进行纯培养后进行菌液PCR筛选，阳性菌株送上海英骏生物技术有限公司测序，测序正确的克隆质粒命名为pUCm-CJpoIFN-α2。

1.2.5 从江香猪源IFN-α2序列分析 用在线服务器(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)对从CJ-poIFN-α2基因编码的蛋白质进行理化性质分析；采用SOPMA在线服务器(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)预测蛋白质二级结构；采用DNAStar程序中的Protean软件分析预测CJ-poIFN-α2基因编码蛋白B细胞表位各参数；采用SignalP-4.1在线服务器对CJ-poIFN-α2基因编码氨基酸序列蛋白信号肽进行预测和分析；下载GenBank不同源的IFN-α2核苷酸序列，以及野猪的IFN-β和IFN-γ核苷酸序列，详细信息见表1，采用DNAStar程序中的MegAlign软件分析CJ-poIFN-α2核苷酸序列的同源性，并用MEGA5.0中的N-J方法构建CJ-poIFN-α2核苷酸序列的系统进化树。

表1 参考序列相关信息

2 结果

2.1 CJ-poIFN-α2 PCR结果

提取从江香猪肝脏组织总RNA，经RT-PCR获得从江香猪源IFN-α2，PCR产物条带见图1，测序结果显示CJ-poIFN-α2编码区长为546 bp。

M.DNA标准DL 5 000；1.IFN-α2的PCR产物M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR products of IFN-α2

2.2 CJ-poIFN-α2序列分析结果

2.2.1 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白质理化性质分析 从江香猪IFN-α2基因编码蛋白质理化性质分析结果显示，CJ-poIFN-α2基因编码区全长为546 bp，编码181个氨基酸，20种氨基酸中含量较高的氨基酸有亮氨酸(15.5%)、丙氨酸(11.6%)、丝氨酸(8.3%)、谷氨酰胺(7.7%)，而含量较低的氨基酸有色氨酸(1.1%)，酪氨酸(1.7%)、赖氨酸(1.7%)和天冬酰胺(1.7%)；编码蛋白分子量约为20.31 ku，等电点为5.84(图2)。

2.2.2 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白质二级结构分析 用SOPMA在线服务器预测CJ-poIFN-α2基因编码蛋白质二级结构。预测结果表明从江香猪IFN-α2基因编码蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主(图3和表2)。

图2 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白理化性质预测

h.α-螺旋；t.β-转角；c.无规则卷曲；e.β-折叠h.Alpha helix；t.Beta turn；c.Random coli；e.Extended strand

二级结构名Name of secondary structureα-螺旋/% Alpha helixβ-转角/% Beta turnβ-折叠/%Extended strand无规则卷曲/%Random coliIFN-α2 60.22(109/181)7.18(13/181)4.97(9/181)27.62(50/181)

2.2.3 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白B细胞多参数分析 采用DNAStar程序中的Protean软件分析预测CJ-poIFN-α2基因编码蛋白B细胞表位各参数，Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Jameson-Wolf法和Emini法分别分析该蛋白亲水性、柔韧性、抗原指数和氨基酸表面可及性。综合分析结果表明，从江香猪IFN-α2基因编码蛋白B细胞表位主要位于46-48、56-58、70-73、155-159、175-178aa，详见图4和表3。

2.2.4 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白信号肽预测 采用SignalP-4.1在线服务器对CJ-poIFN-α2基因编码氨基酸序列蛋白信号肽进行预测和分析，结果显示，CJ-poIFN-α2基因编码氨基酸序列蛋白具有信号肽，综合考虑S值、C值和Y值的得分，第23 aa-24 aa位点预测为信号肽酶切位点(图5)。

图4 CJ-poIFN-α2氨基酸序列的B细胞多参数分析

预测参数Prediction parameters预测结果(aa)Prediction results(aa)亲水性 Hydrophlicity53-61,157-159柔韧性 Flexibility26-30,46-49,56-58,61-73,85-87,92-96,101-103,111-118,131-138,155-160,175-178抗原指数 Antigenicity46-48,52-59,65-70,93-96,155-160,175-180表面可及性 Surface Probability plots27-29,43-47,55-58,70-74,115-117,134-136,143-147,153-159,175-181合计 Total46-48,56-58,70-73,155-159,175-178

图5 CJ-poIFN-α2基因编码蛋白信号肽预测结果

2.2.5 CJ-poIFN-α2核苷酸同源性分析结果 将CJ-poIFN-α2基因与人源、马源、绵羊源、鸡源、犬源、猪源和牛源等IFN-α2核苷酸序列进行同源性比对分析。结果表明CJ-poIFN-α2核苷酸与猪源IFN-α2(GenBank登录号：DQ249002；NM-001130219)同源性最高，为98.7%，而与鸡源IFN-α2(GenBank登录号：XM-015277439)核苷酸序列同源性最低，为32.6%；与猪源IFN-β(GenBank登录号：JF906509)、IFN-γ(GenBank登录号：GU433229)同源性为38.5%和20.8%，结果见图6。进一步比对发现CJ-poIFN-α2与猪源IFN-α2核苷酸序列存在7处碱基的差异，分别是C354T、G392C、T428C、G468A、C477T、G499A、G520T；氨基酸序列比对结果发现存在4处氨基酸的差异，分别是G131A、V143A、V167I、A174S(图7和图8)。

2.2.5 CJ-poIFN-α2基因系统进化树分析 采用MEGA5.0中的N-J方法构建CJ-poIFN-α2基因与不同源的IFN-α2基因的系统进化树。系统进化树结果表明，鸡源IFN-α2基因与其他物种的IFN-α2基因构成2个分支，显示鸡源的IFN-α2基因与其他物种的IFN-α2基因遗传关系较远；CJ-poIFN-α2基因与野猪源的IFN-α2基因在同一分支，两者遗传关系最近(图9)。

图6 CJ-poIFN-α2核苷酸同源性分析结果

图7 CJ-poIFN-α2核苷酸比对差异

图8 CJ-poIFN-α2氨基酸比对差异

3 讨论

IFN-α是机体内白细胞经诱导刺激后分泌产生的一种糖蛋白，具有广谱抗病毒、抗肿瘤、调节机体体液免疫和细胞免疫等多种生物学活性，近年来开发的长效干扰素聚乙二醇(PEG)-IFNα和重组人血白蛋白(rHSA)-IFNα在临床上得到了广泛的应用[17]。人的IFN-α基因编码的前体蛋白经翻译后加工成为一条为166个氨基酸的单体肽链，没有糖基化，肽链前23个氨基酸为信号肽，在蛋白分泌出细胞膜时被切除，我们扩增的从江香猪IFN-α2编码区长为546bp，预测结果显示猪的IFN-α2编码的肽链前23个氨基酸同样是信号肽序列。有研究报道，干扰素存在种属特异性，而且亲源关系越近同源性越高，如人的IFN-α与猴的同源性为87.86%，而与犬和鼠的同源性则不到70%[18]。将克隆得到的从江香猪源IFN-α2核苷酸序列与人源、马源、绵羊源、鸡源、犬源、猪源和牛源等IFN-α2核苷酸序列进行同源性比对分析，发现从江香猪源IFN-α2核苷酸序列与猪源IFN-α2同源性最高，为98.7%，而与鸡源IFN-α2核苷酸序列同源性最低，为32.6%；进一步与猪源IFN-α2核苷酸序列进行比对发现，从江香猪源IFN-α2核苷酸序列存在7处碱基的变异，与推导的猪源氨基酸序列存在4处氨基酸的差异，说明从江香猪源IFN-α2保守性相对较高，但这些碱基的差异是否与猪的品种、抗病活性存在一定的相关性还有待进一步研究。

图9 CJ-poIFN-α2系统进化树分析

贵州从江香猪是我国稀有的微型地方优良品种，主产于贵州省从江县。贵州从江香猪作为地方优异的脂肪型小型猪种，具有体型矮小、基因纯合、适应性和抗病力强等优点，是开展相关疾病研究的理想实验动物模型，具有广阔的开发利用前景[19]。本研究通过RT-PCR、克隆测序等方法获得从江香猪源IFN-α2基因编码区，并采用生物学软件对该序列进行生物信息学分析，试验结果为后期进一步研究干扰素的生物学活性，加快从江香猪的资源开发与利用，以及进一步发掘香猪机体免疫因子奠定基础。