布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

成 璐，张冬星，吴 娟，李 影

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118)

布鲁菌属是一组微小的球杆状革兰阴性菌，宽0.3 μm～0.6 μm，长0.6 μm～1.5 μm，为无芽胞、无鞭毛、不形成荚膜的兼性胞内病原菌，主要感染牛、羊、猪、鹿等哺乳类动物及人[1]。根据宿主易感性不同，有6个经典的种，即羊布鲁菌(Brucellamelitensis)、牛布鲁菌(B.abortus)、猪布鲁菌(B.suis)、绵羊布鲁菌(B.ovis)、犬布鲁菌(B.canis)和沙林鼠布鲁菌(B.neotomae)。此外，从田鼠中分离到了B.microti，从海洋动物鲸和海豚中分别分离到了B.pinnipedialis和B.ceti，从病人乳房植入体中分离到了B.inopinata。其中牛、羊和猪种布鲁菌最为常见，且羊布鲁菌的侵染力与感染力最强，对人的危害也是最大的，其次是猪布鲁菌、牛布鲁菌和犬布鲁菌。绝大多数人感染的布鲁菌病由羊布鲁菌引起[2-3]。

目前，已有多种布鲁菌抗原被证明可以作为潜在的保护性抗原。L7/L12蛋白属于核蛋白，为重要的免疫优势抗原，在布鲁菌各菌株中具有高度的保守性[4]。其中，以L7/L12为基础构建的疫苗可以诱导较强的细胞免疫，在小鼠感染模型中具有显著的抵抗作用[5]。以布鲁菌核糖体蛋白粗提物作为疫苗抗原的研究最早可追溯到20世纪70年代，而重组蛋白L7/L12的提取方法也在不断改进。司瑞等用原核表达载体pGEX-4T-1表达了L7/L12基因，用GSTrap FF亲和层析法获得了布鲁菌重组蛋白L7/L12[6]。梁晓英等用原核表达载体pET-28a(+)构建了重组原核表达质粒pET-28a-L7/L12，使用Ni-NTA亲和层析法获得了布鲁菌重组L7/L12蛋白，且该重组蛋白以包涵体形式表达[7]。

本试验以布鲁菌S2型减毒活疫苗基因组为模板，克隆其L7/L12基因，用原核表达系统表达重组L7/L12蛋白，并制备其多克隆抗体，以期为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 布鲁菌S2型减毒活疫苗，大肠埃希菌Top10、BL21(DE3)感受态细胞，原核表达载体pET-28a(+)由上海市公共卫生临床中心病原细菌感染与免疫课题组保存。

1.1.2 实验动物 SPF级Balb/c小鼠，雌性，6周龄～8周龄，体重20 g左右，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，正常饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部SPF级动物房中。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶为NEB公司产品；DNA Marker、PrimerSTAR GXL DNA聚合酶、dNTPs和蛋白质Marker为TaKaRa公司产品；琼胶糖凝胶回收试剂盒和小量细菌质粒DNA抽提试剂盒为Axygent公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG为Abbkine公司产品；化学发光底物为Millpore公司产品；Ni-Bind Resin为GE Amersham公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中布鲁菌L7/L12蛋白基因序列 (GenBank number:F362131.1) 设计1对特异性引物，引物序列为：F:5′-GCGGATCCATGGCTGATCTCGCAAAGAT- CG-3′(下划线部分为BamHⅠ酶切位点),R:5′-CCCTCGAGTTACTTGAGTTCAACCTTGGCG- C-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)，预期扩增的片段大小为375 bp，引物浓度为10 μmoL/L，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 L7/L12基因的扩增及纯化 以S2型减毒活疫苗基因组为模板，F、R为引物，PCR扩增L7/L12基因完整编码区片段，PCR反应体系50 μL：Primer Star DNA酶1.5 μL，5×Primer Star buffer 10 μL，上、下游引物F/R各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，dNTPs 4 μL，ddH2O补足体系。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸7 min。PCR扩增产物用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA胶回收纯化试剂盒纯化回收PCR产物。

1.2.3 重组质粒的构建与鉴定 将L7/L12基因的PCR扩增产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，胶回收L7/L12基因片段和载体酶切产物，按照T4 DNA连接酶使用说明书，于22℃连接1 h。将10 μL连接产物转化至Top 10感受态细胞中,涂布于含50 μg/mL卡那霉素(K+)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。阳性克隆经PCR筛选，提取重组质粒，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-L7/L12。

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1.2.4 重组蛋白的诱导表达 将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆，接种于LB液体培养基(K+)，37℃培养过夜。次日菌液按1∶100接种于250 mL LB培养基(K+)，37℃、220 r/min摇床培养3 h～4 h至OD600nm值为0.6左右。加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃诱导3 h，离心收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，进行150 g/L SDS-PAGE分析。

1.2.5 重组蛋白的纯化 将重组表达菌大量培养并进行IPTG诱导表达后，4℃离心收集菌体，菌体沉淀经PBS洗涤2次，用25 mL PBS重悬菌体，在冰浴中进行超声破碎至菌体变清亮，4℃离心收集上清，将上清通过已平衡好的Ni2+NTA His Bind Resin柱，在重力作用下完全通过镍柱后，用含20 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗脱目的蛋白，再用不同咪唑浓度(40、80、120、160、200、400 mmol/L)的洗脱缓冲液洗柱，收集洗脱的目的蛋白，进行150 g/L SDS-PAGE分析。将纯化的重组蛋白进行透析，并用PEG 8000进行浓缩，SDS-PAGE分析蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度，置-80℃保存。

1.2.6 小鼠多克隆抗体的制备 将纯化的布鲁菌L7/L12蛋白皮下多点注射免疫Balb/c小鼠，免疫用量为25 μg/只，取纯化的重组蛋白rL7/L12与完全弗氏佐剂1∶1乳化后进行首次免疫，空白对照组注射等体积的PBS，14 d后取纯化的重组蛋白与不完全弗氏佐剂等量乳化后进行加强免疫3次，每隔2周加强免疫1次，最后1次免疫后的14 d，眼眶采血，3 000 r/min离心10 min分离血清，置-80℃保存。

1.2.7 小鼠多克隆抗体的效价测定 用间接ELISA方法检测L7/L12蛋白小鼠多克隆抗体效价：以纯化后的L7/L12重组蛋白包被96孔酶标板，2 μg/孔，4℃包被过夜，一抗为不同稀释倍数的L7/L12蛋白小鼠多克隆抗体，PBS组小鼠血清为阴性对照，1∶8 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，用酶标仪检测450 nm处吸光值。判定标准为：以PBS组小鼠血清为阴性对照，高于阴性血清OD450nm值2倍的最高血清稀释度为抗体效价。

1.2.8 多克隆抗体的 Western blot分析 将纯化的重组蛋白经150 g/L SDS-PAGE分离后，将凝胶转移到PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h；加入L7/L12蛋白小鼠多克隆抗体(1∶2 000稀释)，4℃ 孵育过夜；用TBST缓冲液洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶8 000稀释)，37℃孵育1 h；TBST洗涤3次，加入化学发光底物显影，进行Western blot分析。

2 结果

2.1 L7/L12基因扩增产物的鉴定

L7/L12基因的PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在375 bp处扩增得到一条特异性条带(图1)，与预期大小一致。

M.DNA标准DL 2 000; 1.L7/L12 基因PCR产物M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of L7/L12 gene

2.2 重组表达质粒的鉴定

重组表达质粒pET-28a-L7/L12，经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，可见大小约5 300 bp(pET-28a(+))和375 bp(L7/L12基因)的2条特异性条带，与预期目的条带大小相符(图2)。测序结果与GenBank中已有的L7/L12基因序列(GenBank number:F362131.1)同源性达到100%，进一步表明重组质粒pET-28a-L7/L12构建成功。

M.DNA标准DL 5 000; 1.pET-28a-L7/L12的BamHⅠ+XhoⅠ双酶切产物; 2.PCR扩增产物；

M.DNA Marker DL 5 000; 1.Products from pET-28a-L7/L12 digested byBamHⅠ andXhoⅠ; 2.PCR product

图2重组表达质粒的PCR及酶切鉴定

Fig.2 PCR and restriction enzyme digestion analysis of the
recombinant plasmid pET-28a-L7/L12

2.3 重组蛋白表达和纯化产物的鉴定

重组菌株经IPTG诱导后收集菌体超声破碎，菌体裂解液经150 g/L SDS-PAGE分析，可见重组L7/L12蛋白在大肠埃希菌中高水平表达，分子质量约为17 ku，且在咪唑浓度为160 mmol/L时rL7/L12蛋白条带单一，蛋白纯度最高(图3)。经BCA法测定，其蛋白浓度为0.715 mg/mL。

M.广谱蛋白标准; 1.pET-28a空载体; 2.未诱导的pET-28a-L7/L12全菌; 3.诱导后pET-28a-L7/L12菌体裂解上清; 4.诱导后pET-28a-L7/L12菌体裂解沉淀; 5.纯化的重组L7/L12蛋白

M.Protein Marker; 1.pET-28a as control; 2.Total protein of pET-28a-L7/L12 without induction; 3.Supernatant of pET-28a-L7/L12 after induction; 4.Precipitate of pET-28a-L7/L12 after induction; 5.Purified rL7/L12 protein

图3重组L7/L12蛋白表达及纯化

Fig.3 Expression and purification of fusion L7/L12 protein

2.4 小鼠多克隆抗体的效价

将纯化的重组L7/L12蛋白免疫组和PBS对照组血清进行1∶1 000稀释，2倍倍比稀释后进行间接ELISA检测，按照阳性血清与阴性血清D450nm值的比值(P/N)大于2的判定标准，L7/L12蛋白小鼠多克隆抗血清效价为1∶128 000，表明重组L7/L12蛋白具有良好的免疫原性(图4)。

图4 L7/L12蛋白多克隆抗体效价

2.5 多克隆抗体的Western blot分析

Western blot结果表明，本试验制备的小鼠多克隆抗体能与重组L7/L12蛋白发生特异性反应，在大小约17 ku处可见一条特异性杂交条带，且与PBS组小鼠血清反应无特异性条带出现，说明所制备的抗血清具有良好的反应特异性(见图5)。

M.预染蛋白标准; 1.PBS组小鼠血清; 2.小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体

M.Protein Marker; 1.Negative serum; 2.Polyclonal antibody against the L7/L12 protein

图5多克隆抗体的Western blot分析

Fig.5 Western blot analysis of the polyclonal antibody

3 讨论

布鲁菌病最早在欧洲发现。1860年，Morston根据临床特点、尸体剖检结果等进行分析研究，将其认定为临床上一种独立的传染病，命名为“地中海弛张热”[8]。1886年，由David Bruce首次从一个死亡于“马耳他热”的士兵身上分离得到病原菌，后来证明为羊布鲁菌[9]。此间，经过人类不断研究，完善了对该菌的认识。布鲁菌感染家畜和野生动物时，主要引起妊娠母畜流产和公畜不育[10]。此外，该菌也严重威胁着人类的健康，人类感染布鲁菌，可产生许多非特异性表症，如间歇性发热、出汗、寒颤、不适、恶心，还有厌食、头痛、肌痛和背痛[11]。迄今为止，对于人布鲁菌病还没有可用的疫苗，有关疫苗的人体临床试验的相关数据也很少[12]。因此，为了研究安全有效的疫苗，深入了解布鲁菌感染所产生的免疫反应和保护性机制是必不可少的。当前研究表明，布鲁菌感染后，机体可产生细胞免疫反应和体液免疫反应，主要通过诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞反应或促炎性细胞因子，活化巨噬细胞和树突状细胞(DCs)，从而增强机体的细胞免疫反应[13]。

L7/L12蛋白以4个拷贝形式存在于核糖体亚单位中，C端具有与EF-G和EF-Tu相结合的延伸因子，N端的二聚体与L10的核糖体蛋白结合，这种结构有利于在GTP水解过程中获取能量。研究发现，布鲁菌L7/L12蛋白能够特异性刺激感染动物的单核细胞，上调IFN-γ的转录和表达，从而对机体起到保护作用[14]。Oliveira J等[15]用原核表达载体构建了L7/L12-BMP融合蛋白，腹腔注射免疫小鼠，免疫3次后以B.abortus攻毒，发现其保护效率可达到S19疫苗的一半。Mallick等将L7/L12核糖体蛋白进行脂化形成一种牛布鲁菌B-T细胞抗原，结果证明重组L7/L12蛋白的脂质体形式大大提高了重组蛋白的免疫原性，能够诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应，且其攻毒保护效果也明显增加[16]。Singh D等[17]用PLGA(85∶15)纳米粒在小鼠体内递呈rLl7/L12，结果表明用这种纳米载体可以抗B.abortus544感染，可替代传统蛋白佐剂。Luo D等[18]研制了能同时表达布鲁菌L7/L12蛋白和Omp16蛋白的二价DNA疫苗，该二价疫苗能够刺激T淋巴细胞的大量增殖与IFN-γ产生，诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应，且其保护水平明显高于单个抗原。Tabynov K等[19]首次构建了以流感病毒为载体编码布鲁菌L7/L12蛋白的疫苗，该载体疫苗可以提供与商品化疫苗B.abortusS19和B.abortusRB51相当的保护效果。Du Z Q等[20]以布鲁菌rL7/L12-BLS免疫家兔检测其免疫原性，结果表明该融合蛋白可诱导高水平的IgG，且rL7/L12-BLS组和rL7/L12组IFN-γ含量显著上调。因此，L7/L12作为一种优秀的T细胞免疫优势抗原，可作为潜在的布鲁菌疫苗候选分子。

本试验用pET-28a原核表达载体高效表达了布鲁菌L7/L12重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析法获得了高纯度的布鲁菌重组L7/L12蛋白。SDS-PAGE分析表明布鲁菌L7/L12蛋白未经IPTG诱导也可大量表达，且存在可溶和包涵体两种形式，为蛋白的进一步纯化和性质鉴定提供了基础材料。Western blot分析显示，该重组蛋白能与布鲁菌rL7/L12免疫小鼠血清发生特异性反应，说明L7/L12的结构在大肠埃希菌中得到了正确折叠，其免疫学活性没有受到影响，且特异性强。间接ELISA也证明了布鲁菌L7/L12蛋白具有良好的抗原性，是一种重要的布鲁菌诊断抗原和疫苗后选分子。综上所述，本研究成功制备了纯化的重组L7/L12蛋白和小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体，为下一步比较布鲁菌DNA疫苗和重组蛋白亚单位疫苗的免疫效果提供了材料，为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。