柴胡疏肝散精简方对抑郁大鼠中缝核内5-羟色胺及色氨酸羟化酶2的影响

高雪松 赵静洁 王永志 杜 仪 王安娜 张银凤 李 丽*

(1.首都医科大学附属北京友谊医院中医科，北京 100050;2.北京市隆福医院康复医学科北苑院区，北京 100010; 3.首都医科大学附属北京友谊医院国际医疗部，北京 100050)

抑郁症是严重危害人类心身健康的常见精神疾病，以情绪低落、注意力不集中、失眠、健忘等为主要表现[1]。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)[2]的一项报告，全世界约有3.22亿人口受抑郁困扰，占全球人口的4.4%。中医认为抑郁症主要由肝气郁结所致，治疗以疏肝解郁为法，柴胡疏肝散为疏肝解郁的基本方剂，临床中以此方精简治疗肝郁气滞型抑郁症患者，效果显著。在抑郁症的诸多发病机制中，单胺递质假说获得了Vidal[3]的认同，即单胺类神经递质的缺乏导致抑郁症的发生，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作为重要的单胺类神经递质，其绝对或相对不足是抑郁症的重要发病机制[4]。色氨酸羟化酶2(tryptophan hydroxylase 2，TPH2)多存在于脑干中缝核5-HT神经元内，是合成5-HT的重要限速酶[5]，与5-HT的含量密切相关。故本研究拟探讨柴胡疏肝散精简方(Simplified Chaihu-Shugan Powder，SCSP)对抑郁样大鼠中缝核内5-HT及TPH2的影响，探究精简方治疗抑郁症的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量180～200 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验单位使用许可证编号：SYXK(京)2012-0023，实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004，质量检测单位：中国医学科学院医学实验动物研究所。首都医科大学附属北京友谊医院实验动物中心动物房饲养，12 h昼夜节律(8∶00至20∶00时)，室温维持在21～23 ℃，湿度维持在30%～40%，所有实验均在白天(9∶00至17∶00时)进行，实验期间自由饮食饮水。

1.2 药物

利血平注射液(天津金耀药业有限公司生产、批号：H12020905)；盐酸氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司生产、分包装药品批准文号及批号：国药准字J2012001、4145A)；柴胡疏肝散精简方(北京康仁堂药业有限公司生产；处方：柴胡9 g、白芍15 g、枳壳9 g、香附9 g；褐色免煎颗粒)；蒸馏水。

1.3 主要试剂

5-羟色胺 (5-HT，美国Sigma公司)、3,4二羟基苄胺 (DHBA，美国Sigma公司)、1-辛烷磺酸钠、一水柠檬酸、乙腈、高氯酸、焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸、实验用水18.20 MΩ超纯水等。超纯RNA提取试剂盒，HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，UltraSYBR Mixture(With ROX)，DNase1，5x RNA Loading Buffer(中国康为世纪生物科技有限公司)。

1.4 主要仪器

美国ESA公司产品：5600A型高效液相色谱仪(ESA Model 5600A-HPLC系统)，8通道库仑电化学检测器(Model 5600A Coularray Detector-8)；电极：ESA Model 6210 four channel cell, ESA Model 582型双高压泵，ESA Model 542全自动控温进样器，控制软件：ESA Software Version 3.1。德国Sigma-2K15超速低温离心机、MILLI-Q-B超纯水器、MJ-300超声波发生器、AG285电子分析天平、微型电动匀浆器。涡旋振荡仪(QL-902、海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机(德国Eppendorf公司)，分光光度计(美国Therno Scientific公司)，荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)。旷场软件及配件(美国Harvard Apparatus公司)；电子秤[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，TD3台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)等。

1.5 分组及造模

实验前进行旷场实验，选择水平运动总距离相近的大鼠进行实验。采用随机区组法分组：40只大鼠分空白组(Control)、模型组(Model)、氟西汀组(Fluoxetine)、SCSP组，每组10只。分组完成后，适应性喂养1周开始正式实验。正式实验前，按人与动物等效药物剂量换算并参照Kulkarni等[6]方法，用蒸馏水将利血平注射液配成0.1 g/L溶液，各实验组按照0.3 mg/kg腹腔注射；用蒸馏水将盐酸氟西汀分散片配成0.4 g/L溶液，按成人所需剂量折算，60 kg每日剂量是20 mg，即：0.33 mg/kg，大鼠的用量一般取人用量的6～8倍作为中剂量，本次实验按5 mL(2 mg)/kg灌胃给药；用蒸馏水将SCSP免煎颗粒溶解，按成人所需剂量折算，按5 mL(8 g)/kg灌胃给药；模型组灌胃等量蒸馏水，空白组予同等剂量蒸馏水腹腔注射及灌胃。腹腔注射与灌胃给药均在每天上午9∶00至12∶00进行，连续14 d。

1.6 观察指标

1)外观及形态：每天实验结束后观察大鼠上睑下垂1/2只数，毛发，形态(是否有震颤、竖毛、弓背样、蜷缩样)，大便情况等。

2)体质量及体质量增量：正式实验开始后隔天称量体质量，计算实验前后体质量增量。

3)糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)：参考文献[7]并结合既往实验进行糖水偏好实验，实验前给予大鼠2瓶相同的事先配好的1%(质量分数)糖水，适应24 h；随后换成1%(质量分数)糖水、纯净水各1瓶，适应24 h；随后禁食禁水24 h；随后给予大鼠测定好质量的糖水及纯净水各1瓶，24 h后，分别称量剩余糖水及纯净水质量，计算大鼠糖水摄入量、纯净水摄入量，计算糖水偏好指数。糖水偏好指数(%)=糖水摄入量/(糖水摄入量+纯净水摄入量)[8]。

4)强迫游泳实验(forced swimming test，FST)：参考文献[9]并结合既往实验进行强迫游泳实验，实验前将透明玻璃水桶(直径15 cm，高60 cm)倒入清水，水温计测量水温在23～27 ℃，水深约40 cm，随后将大鼠独置桶内进行强迫游泳实验，用摄像机记录5 min游泳录像，随后两位实验人员采用双盲法计算大鼠游泳不动时间，取双方记录平均值为最终游泳不动时间结果。游泳不动时间的标准为大鼠在水中停止挣扎或漂浮的状态，将大鼠躯体蜷缩，前爪停止刨水，偶有后爪滑动但身体保持垂直，鼻孔露出水面的时间记为游泳不动时间。

1.7 生物样本的收集

将大鼠断头取血后，取出完整脑组织，迅速放入干冰中预冷，随后取出置于-80 ℃冰箱冰冻保存备用。将冰冻脑组织取出，置于切片机中，参照大鼠脑立体及平面定位图谱进行定位，将中缝核部位脑组织取出。

1.8 中缝核内5-HT含量的测定

以高效液相色谱-电化学法(high performance liquid chromatography-electrochemical detector，HPLC-ECD)测定中缝核内5-HT的浓度。依次进行标准液和蛋白沉淀工作液的配制、组织样品制备、用5-HT标准液及内标DHBA标准液稀释成40、20、10、5、2.5μg/L 5个不同浓度，依次测定后以对照品峰面积比内标峰面积，对浓度进行线性回归并计算相关系数r2，最后经ESA软件工作站计算出各物质含量上样品的测量值[10]。实际含量换算公式如下：

1.9 中缝核内TPH2 mRNA含量的测定

以反转录聚合酶链式反应法(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)测定中缝核内TPH2的含量。依次进行引物设计、提取总样本RNA、RNA电泳、RNA消化、反转录等，最后用Line Gene 9600 Plus型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。根据Real Time PCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式[11]。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 外观及形态

与空白组比较，模型组、氟西汀组及SCSP相继出现不同程度的眼睑下垂、毛发竖立、弓背紧张、大便偏稀。与模型组比较，氟西汀组及SCSP组上述情况发生的比例减少、程度减轻。

2.2 体质量及体质量增量

造模前，各组大鼠间体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模14 d后，与空白组比较，模型组大鼠体质量、体质量增量明显减少(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀组及SCSP组大鼠体质量、体质量增量明显增加(P<0.01)，详见表1。

表1 各组大鼠体质量与体质量增量比较Tab.1 Comparison of weight and weight gain in each group

2.3 糖水偏好实验

与空白组比较，模型组大鼠糖水偏好指数明显降低(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀组及SCSP组大鼠糖水偏好指数增加(P<0.05),详见表2。

表2 各组大鼠糖水偏好指数比较Tab.2 Comparison of sucrose preference in each group

*P<0.01vscontrol group；#P<0.05vsmodel group;SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

2.4 强迫游泳实验

与空白组比较，模型组大鼠游泳不动时间明显增加(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀组及精简方组大鼠游泳不动时间明显减少(P<0.01),详见表3。

表3 各组大鼠游泳不动时间比较Tab.3 Comparison of immobility time in each group

*P<0.01vscontrol group；#P<0.01vsmodel group；SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

2.5 中缝核内TPH2、5-HT浓度比较

与空白组比较，模型组大鼠中缝核内TPH2、5-HT浓度明显减少(P<0.01)，氟西汀组及SCSP组差异无统计学意义；与模型组比较，氟西汀组及SCSP组大鼠中缝核内TPH2、5-HT浓度明显增加(P<0.01)，详见表4。

3 讨论

随着社会的发展和生活节奏的加快，人们长期处于压力之下，使得越来越多的人深受抑郁症的困扰。中医认为，肝郁气滞为抑郁症发病的基本病机，临床以抗抑郁复方治疗抑郁症，效果显著，其中，疏肝类中药复方占有重要地位[12]。柴胡疏肝散精简方是根据《景岳全书》[13]中柴胡疏肝散经典原方，结合目前抑郁症常见的病因病机，对组方进行精简化裁而来，方中柴胡入足少阳、厥阴经，在经主气，在脏主血，宣畅气血，散郁调经；白芍有养肝阴、调肝气、平肝阳、缓急止痛之功效，《本草备要》[14]言其可“补血，泄肝，益脾，敛肝阴”。枳壳理气宽中，行滞消胀,用于胸胁气滞，胀满疼痛[15]；香附味甘辛，气重味轻，乃血中气药，诸血气方中所必用者也，快气开郁，逐瘀调经[16]。四药配伍，构成柴胡疏肝散精简方，具有疏肝理气、养血柔肝之效。

表4 各组大鼠中缝核TPH2、5-HT浓度比较Tab.4 Comparison of the contents of TPH2 and 5-HT in raphe nucleus in each group

*P<0.01vscontrol group，#P<0.01vsmodel group；TPH2：tryptophan hydroxylase 2；5-HT：5-hydroxytryptamine；SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

王永志等[17]发现，利血平腹腔注射后的模型组大鼠出现眼睑下垂、毛发竖立、弓背紧张等表现，同时伴有体质量下降，行为学提示其快感缺失、绝望，这与抑郁症患者的情绪低落，易紧张焦虑，兴趣丧失，悲观绝望等状态相似。此外，模型组中缝核内5-HT较空白组明显下降，这与利血平耗竭脑中单胺类神经递质的药理机制相符。腹腔注射利血平建模不仅模拟了抑郁症患者的临床行为表现,更模拟了抑郁症患者脑内单胺类递质系统功能降低的病理机制，成模迅速，模型稳定。

同时，氟西汀组及SCSP组较模型组体质量、体质量增量、糖水偏好指数增加，说明氟西汀和精简方均可改善抑郁样大鼠的抑郁样状态，说明两者均具有一定的抗抑郁作用，可对其机制进行进一步分析。

单胺类神经递质假说认为5-HT的绝对或相对缺乏是抑郁症发病的重要因素，中缝核是单胺能中心传递信息的核心脑区[18-19]，是产生5-HT的主要区域。5-HT主要由中缝核内5-HT能神经元内的色氨酸在TPH2的作用下生成，TPH2是5-HT生成过程中重要的限速酶。本实验研究发现，氟西汀组及SCSP组中缝核内5-HT浓度较模型组均明显增多，说明两者均通过某种途径增加了中缝核内5-HT浓度。此次实验中氟西汀组、SCSP组与模型组比较可以看出，氟西汀组、SCSP组TPH2浓度较模型组明显增多，由此可推断，氟西汀、SCSP可增加中缝核内TPH2浓度从而促进色氨酸更多的转化为5-HT，进而使中缝核内5-HT浓度增加，发挥抗抑郁作用。

综上所述，SCSP可明显改善利血平致抑郁样大鼠的抑郁状态，与阳性对照药氟西汀效果相当，这可能与其增加中缝核内TPH2的浓度使得5-HT浓度增加相关。