精子DNA碎片指数对囊胚发育的影响

王宇峰 曹芳 于春梅 夏西洋 戴秀亮 高亭亭 陈莉

[摘要]目的 探讨分析体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中男方精子DNA碎片指数（DFI）对囊胚发育的影响。方法 选取本中心2017年1～12月收治的579例进行囊胚培养的IVF周期作为研究对象，按照男方DFI检测值分为低DFI组（DFI<20%，470例）和高DFI组（DFI≥20%，109例），比较两组的囊胚培养情况。结果 低DFI组的囊胚形成率高于高DFI组，差异有统计学意义（P<0.05）。两组的可用囊胚率及优质囊胚率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 DFI低于20%时进行囊胚培养能获得更多的囊胚，但是在可用囊胚率及优质囊胚率上却不能带来明显的提高。

[关键词]精子DNA碎片指数；体外受精-胚胎移植；囊胚

[中图分类号] R331 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）11（c）-0110-03

[Abstract] Objective To investigate the influence of sperm DNA fragmentation index （DFI） on development of blastocyst during in vitro fertilization-embryo transfer （IVE-ET） cycle. Methods A total of 579 IVF-ET cycles from January to December 2017 in our center were selected as the research object， and they were divided into the low DFI group （DFI<20%， 470 cases） and the high DFI group （DFI≥20%， 109 cases） based on the value of husband′s DFI， and the development of blastocyst of two groups was analyzed. Results The blastocyst formation rate of the low DFI group was higher than that of the high DFI group （P<0.05）， and the useful blastocyst formation rate and high quality blastocyst formation rate of the two groups were similar， with no significant difference （P>0.05）. Conclusion There will be a higher blastocyst formation rate when the DFI is below 20%， however， the quality of blastocyst will not be improved.

[Key words] Sperm DNA fragmentation index； In vitro fertilization-embryo transfer； Blastocyst

随着辅助生殖技术的发展，对男性不育的认识逐渐深入。作为遗传信息的载体，精子染色质完整性对于生育健康后代具有重要意义，而精子DNA碎片指数（DFI）正是反映精子DNA完整性的一个重要参数。囊胚培养及单囊胚移植是目前辅助生殖过程中比较主流的方案[1]，因此囊胚的形成率及囊胚质量对于治疗成功影响重大。通常认为，父源性基因在胚胎发育至6～8细胞期时才开始体现[2]，也就是说，囊胚发育过程伴随着父源性基因的初步表达，囊胚的形成与精子DNA完整性之间可能有着密切的联系。关于精子DFI与囊胚发育之间联系的研究目前少见，本研究回顾性分析了精子DFI对囊胚发育的影响，以探讨两者之间的联系。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年1～12月在本中心实施囊胚培养的579例促排卵周期，根据男方精液DFI检测值分为两组，DFI<20%为低DFI组，共470例；DFI≥20%为高DFI组，共109例。纳入标准为女方盆腔输卵管因素不孕，基础FSH水平<10 mIU/ml，年龄<40岁，用于囊胚培养的卵裂胚数目≥3枚。本研究已经过医院医学伦理委员会审核。

1.2研究方法

1.2.1精子DFI检测 采用精液优化处理与精子核完整性染色试剂盒（星博生物，中国）配合流式细胞仪进行染色及检测。

1.2.2囊胚培养 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期进行到D3时，对卵裂胚进行移植或冷冻处理，将剩下的卵裂胚转移到G-2 PLUS（Vitrolife，瑞典）培养基，置于6%二氧化碳、5%氧气设置的培养箱内继续培养到D5或者D6。

1.3观察指标

囊胚评分：桑椹胚内出现囊腔即表示形成囊胚，根据Garnder囊胚分级法对形成的囊胚进行评分。囊腔扩张4级以上，内细胞团及外滋养层评级都在B以上的为优质囊胚；囊腔扩张4级以上，内细胞团或外滋养层有一个评级为C的称为可用囊胚；囊腔扩张程度未达4级，或者内细胞团和外滋养层都为C级的为不可用囊胚。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，兩组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

共纳入囊胚培养周期579例，其中低DFI组470例，高DFI组109例。两组的女方年龄、男方年龄、不育年限、基础FSH及获卵数之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2兩组囊胚培养情况的比较

低DFI组的囊胚形成率为69.6%，高DFI组的囊胚形成率为63.8%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。低DFI组的可用囊胚率及优质囊胚率与高DFI组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3讨论

近年来，辅助生殖技术快速发展，除了女性因素，男性因素也越来越受到重视。受不育症困扰的育龄夫妇中，存在男性因素的约占2/3[3]。目前临床上主要依靠常规精液分析及精浆生化等检查评估男性不育症患者生育力，这些检查能为男性不育症患者生育力评估提供重要参考，然而受精液质量波动的影响，精液分析检查的结果也可能出现较大波动。另外，精液常规分析的结果还易受实验室检验人员的主观影响。为了寻求其他反映精子质量的指标用来评估男性生育力、预测辅助生殖技术结局，波动小、准确、客观的精子染色质完整性检查逐渐受到重视，精子DNA损伤逐渐成为男性不育及辅助生殖领域的研究热点[4-6]。

目前用于检测精子DNA损伤的方法有精子染色质扩散试验（SCD）、吖啶橙试验（AOT）、末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）、精子染色质结构分析试验（SCSA）等，不同的检测方法得到结果也并不一致。有研究显示，在用AOT检测精子DFI时，DFI检测值的高低并不影响受精与卵裂[7]；而在使用彗星实验时，高DFI会对受精率、临床妊娠率及着床率产生不利影响[8]；另外有研究认为DFI的检测方法中只有TUNEL法能预测IVF的临床妊娠率[9]。造成这些差异的原因可能是由于检测方法的不同、阈值选择的不同、检测精子的处理不同、纳入研究的病例筛选不同、授精方式选择的不同、精子DNA损伤的类型不同等。本研究通过双层密度梯度离心法及上游法优选精子，采用吖啶橙染色[10]配合流式细胞仪检测精子DFI，根据以前相关研究将DFI阈值定为20%，并严格控制病例纳入标准。

以往的动物实验显示，受精及早期胚胎的发育会受到精子DNA完整性的影响。同样，精子DNA完整性可以用来评估男性生育力，精子DFI与精子密度、活率、活力及正常形态精子百分率均成负相关[11-12]。然而精子DFI是否能用来预测胚胎发育及移植结局，是否有助于辅助生殖技术的选择，目前尚无定论[13-15]。精子DFI的高低与正常受精、胚胎发育及妊娠结局似乎并没有直接的联系，这些研究通常只观察到D3卵裂胚阶段。有研究[16]证实精子DNA损伤会对胚胎质量产生不良影响，但是该Meta分析纳入的28项研究中涉及到囊胚阶段的只有3项，其他都是D3以内的卵裂胚发育情况。在本研究中，低DFI组有着更高的囊胚形成率，但对于可用囊胚率及优质囊胚率，两组却无明显差别。人类胚胎的早期发育受母源基因调控，胚胎发育至6～8细胞期时才体现父源性基因，囊胚发育过程伴随着父源性基因的初步表达。在高DFI组，精子DNA损伤比较严重，一旦父源性基因开始启动，受精子DNA损伤诱导，胚胎出现凋亡或阻滞，发育至囊胚阶段的比率就会降低。然而对于可用囊胚及优质囊胚，高DFI似乎并不会产生明显的影响。笔者推测对于这些能发育至可用囊胚及优质囊胚的质量较好的胚胎，可能存在较强的修复能力，精子高DFI带来的不利影响似乎可以被消除。因此，在本研究中，精子高DFI能影响囊胚的数量，但是并不会对囊胚的质量产生不良影响。

综上所述，精子高DFI并不会对可用囊胚及优质囊胚的形成产生不利影响，但由于本研究病例有限，还需要更大规模的多中心临床研究进一步证实。另外还需对囊胚移植后的临床结局及子代情况加以追踪，从而明确对精子DNA损伤的研究在辅助生殖技术应用中的价值。

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