蛋白激酶C活化对兔视网膜色素上皮细胞抗氧化能力的影响及机制研究

卫冬 陈丽娟 教莹莹 李红玉 孙兆义

[摘要]目的 通過激活兔视网膜色素上皮细胞（RPE）内蛋白激酶C（PKC），观察RPE细胞核内转录因子E2相关因子2（Nrf2）的表达情况以及细胞内谷胱甘肽（GSH）的表达水平。方法 应用免疫荧光染色鉴定原代培养兔视网膜色素上皮细胞（RPE），将第3代RPE细胞分为空白对照组（15%胎牛血清的DMEM培养液，n=8）、PMA组（15%胎牛血清的DMEM培养液+4 μl 100 nmol/L PKC特异激活剂佛波酯溶液，n=8）和PMA+BST组（用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制剂鸦胆苦醇溶液预处理RPE细胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培养液，n=8），培养24 h后，采用Western-blot方法检测Nrf2蛋白在胞质和胞核内的表达，采用GSH试剂盒检测各组RPE细胞内GSH的表达，对细胞核内Nrf2及细胞内GSH表达进行相关性分析，采用免疫荧光染色检测Nrf2蛋白在细胞内转位情况。结果 RPE细胞胞质内可见黑色素颗粒，呈长梭形，鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫荧光染色鉴定呈强阳性；Western blot检测结果显示，与对照组比较，PMA组和PMA+BST组胞质内Nrf2蛋白表达显著减少，胞核内Nrf2蛋白表达显著增加，其中PMA组胞质内Nrf2蛋白表达较PMA+BST组显著降低，而细胞核内Nrf2蛋白表达则显著增多（胞质：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）。GSH检测试剂盒检测显示，与对照组比较，PMA组和PMA+BST组细胞内GSH表达显著增高，其中PMA组细胞内GSH表达显著高于PMA+BST组（F=37.64，P<0.05）。细胞核内Nrf2与细胞内GSH表达成正相关（R2=0.908，P<0.05）。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，PMA组和PMA+BST组细胞核内Nrf2蛋白表达增加，发生了核转位，其中PMA组较PMA+BST组核转位更为显著。结论 PKC活化能够促进RPE细胞抗氧化能力，其作用机制与PKC/Nrf2信号通路调节有关。

[关键词]视网膜色素上皮细胞；蛋白激酶C；核因子E2相关因子2；谷胱甘肽

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）11（c）-0016-05

[Abstract] Objective To observe the expression status of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） and glutathione （GSH） in retinal pigment epithelium （RPE） cells following the activation of protein kinase C （PKC） in rabbits. Methods Immunofluorescence staining was used to identify the original generation cultured RPE cells in rabbits. The third generation of RPE cells was divided into the control group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum， n=8）， the PMA group （DMEM culture medium contains 15% fetal bovine serum+4 μl 100 nmol/L PKC specific activator phorbol ester solution， n=8） and the PMA+BST group （pretreatment of RPE cells with 4 μl of 10 μmol/L Nrf2 inhibitor brusatol solution [BST] for an hour， aspirate and add DMEM culture medium containing PMA 4 μl of 100 nmol/L and 15% fetal bovine serum， n=8）， the incubation time of each group was 24 hours， Western-blot was used to detect the expression of Nrf2 protein in cytoplasm and nucleus. Then the GSH kit was used to detect the expression of GSH in RPE cells. And the correlation between the expression of Nrf2 in the nucleus and intracellular GSH was analyzed. Immunofluorescence staining was used to detect the translocation of Nrf2 protein in the cells. Results RPE cells showed melanin granules in the cytoplasm， long spindle-shape， and anti-human keratin （AE1/AE3） immunofluorescence staining showed strong positive. Western blot showed that the expression of Nrf2 protein in cell cytoplasm of the PMA group and the PMA+BST group were significantly down regulated compared with the control group， while the Nrf2 protein expression in cell nucleus was markedly up-regulated （all P<0.05）. Moreover，the difference in the expression of Nrf2 in cytoplasm and nucleus between the three groups was statistically significant （cytoplasm： F=26.62， P<0.05； nucleus： F=29.88， P<0.05）. GSH kit showed that， when compared with the control group， the intracellular expression levels of GSH in the PMA group and the PMA+BST group were significantly increased （all P<0.05）， and the GSH expression level of the PMA group was significantly higher than that of the PMA+BST group （P<0.05）. Nrf2 in the nucleus was positively correlated with GSM expression in the cell （R2=0.908， P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that， compared with the control group， the Nrf2 protein expression in both the PMA group and the PMA+BST group was up regulated in the nucleus， and the nuclear translocation occurred， with more obvious nuclear translocation in the PMA group. Conclusion PKC activation can promote the antioxidant capacity of RPE cells， of which the mechanism of action is related to the regulation of PKC/Nrf2 signaling pathway.

[Key words] Retinal pigment epithelium； Protein kinase C； Nuclear factor erythroid 2-related factor 2； Glutathione

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是眼科常见的导致老年人视力受损的疾病之一，研究已证实氧化应激对视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）所造成的损伤是AMD一个重要的发病机制[1-3]。近年来发现，转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是重要的氧化还原感受器，激活后可提高抗氧化基因的表达，从而达到抗氧化损伤的作用[4-6]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是细胞内重要抗氧化物质，其表达水平揭示细胞的抗氧化能力[7-8]。在其他领域中有研究表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活能诱导Nrf2信号通路，发挥抗氧化应激作用[9-10]，但关于PKC/Nrf2信号在AMD疾病中的表达及作用尚不明确。本研究拟通过体外培养RPE细胞，并应用PKC激动剂PMA激活RPE细胞PKC表达，检测RPE细胞Nrf2表达情况以及GSH表达水平，探讨PKC活化对RPE细胞抗氧化的作用，并结合Nrf2抑制剂BST，阐明PKC/Nrf2信号对RPE细胞的作用机制。

1材料与方法

1.1材料、试剂与实验动物

Nrf2抗、PKC抗体、AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗体为美国Bioss公司产品，BST为加拿大TRC公司产品，细胞浆、核蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMA为碧云天生物科技公司产品，胎牛血清为美国Hyclone公司；电泳仪、电泳槽为上海Tanon公司产品，倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品，倒置荧光显微镜为日本Nikon公司产品。青紫蓝兔12只（24眼雌雄不限），体质量（2.5±0.5）kg，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1兔RPE细胞的培养及鉴定 手术摘除兔眼球，经过无菌生理盐水浸泡，PBS缓冲液冲洗后，去除眼球前节及玻璃体，制成眼杯，消化后收集细胞悬液，加入培养液接种、培养，传代后，应用AE1/AE3鼠抗人角蛋白抗体免疫荧光染色方法进行细胞鉴定，鉴定为RPE细胞后进行分组实验。

1.2.2实验分组及给药干预 取3代近乎融合的RPE细胞进行实验，共计分为空白对照组（15%胎牛血清的DMEM培养液，n=8）、PMA组[15%胎牛血清的DMEM培养液+4 μl 100 nmol/L PKC特异激活剂佛波酯溶液（phorbol12-myristate13-acetate，PMA），n=8]、PMA+BST组[用4 μl 10 μmol/L Nrf2抑制剂鸦胆苦醇溶液（brusatol，BST）预处理RPE细胞1 h后，吸出并加入含PMA 4 μl 100 nmol/L的15%胎牛血清的DMEM培养液，n=8]，实验各组培养24 h。

1.2.3 Western blot检测 按细胞浆-细胞核蛋白提取试剂盒的方法提取各组样品蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品浓度，计算蛋白质含量。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，12%分离胶），湿转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入Nrf2抗体（1∶1000），4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶4000）孵育2 h后再漂洗。ECL化学发光法检测，显色后将胶片进行扫描，采用Image J图像分析系统测定检测蛋白表达的灰度值，分别计算量化试验中蛋白表达的情况及样品蛋白条带/内参对照条带的灰度值。

1.2.4免疫荧光检测 将第3代细胞接种到预先放置盖玻片培养皿中，培养24 h，4%多聚甲醛固定细胞20 min，Nrf2一抗稀释液（1∶100），4℃孵育过夜，荧光二抗室温下孵育1 h，用0.5 μg/ml DAPI避光孵育15 min，于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.2.5 GSH试剂盒检测 用GSH测定试剂盒提供相关试剂制备样本溶液，置于96孔板，用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度值（A值），將GSH溶液分别稀释成50、25、15、10、5、2 mol/L，制作6个点标准曲线，再根据标准曲线计算样本溶液的GSH浓度，对各组的RPE细胞内GSH表达水平进行检测。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用回归方程和R2进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1体外培养兔RPE细胞的鉴定

原代RPE细胞呈球形，细胞质中可见黑色素颗粒（图1A）。培养24～48 h细胞开始贴壁，集落样生长呈不规则多角形，可见清晰透明的圆形细胞核及双核细胞，胞质内含丰富黑色素颗粒（图1B）。7 d左右细胞达到融合状态，呈长梭形，排列致密（图1C）。传代24 h后贴壁，生长速度逐渐加快，每4～5天传代。第3代RPE细胞经鼠抗人角蛋白（AE1/AE3）免疫荧光染色鉴定呈强阳性（图1D）。

2.2 Western blot检测RPE细胞胞核和胞浆Nrf2蛋白相对表达

与对照组比较，PMA组和PMA+BST组胞质内Nrf2蛋白表达显著减少，胞核内Nrf2蛋白表达显著增加，其中PMA组胞质内Nrf2蛋白表达较PMA+BST组显著降低，而细胞核内Nrf2蛋白表达则显著增多（胞质：F=26.62，P<0.05；胞核：F=29.88，P<0.05）（图2、表1）。

2.3免疫荧光染色检测Nrf2蛋白在RPE细胞内转位情况

与对照组比较，PMA组和PMA+BST组RPE细胞核内Nrf2表达显著增强，提示Nrf2发生了核转位，其中PMA组较PMA+BST组核转位更为显著（图3）。

2.4 GSH在RPE细胞内表达

与对照组比较，PMA组细胞内GSH表达显著增高[（90.569±8.101） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.0001]；PMA+BST组细胞内GSH表达亦增高[（71.245±5.317） vs. （47.452±3.172）mol/L，P<0.05]；其中PMA组细胞内GSH表达显著高于PMA+BST组（F=37.64，P<0.05）；PMA组随机抽取四组样本，线性回归方程检测发现细胞核Nrf2及细胞内GSH表达成显著正相关（R2=0.908，P<0.05）（图4）。

3讨论

AMD是一种局限于黄斑区的视网膜慢性进展性疾病，可引起患者视力丧失，并且随着年龄的增长其发病率逐渐升高[11]。研究显示，氧化应激诱发RPE细胞损伤在AMD的发生、发展机制中极为重要[12-13]，所以，如何减少RPE细胞的氧化损伤将对治疗AMD起到重要作用。PKC是一大类磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞内重要的信号传导分子，在多种细胞内广泛表达，通常是以无活性的形式存在于胞浆中，当被激活时，PKC会从胞浆向胞膜上移位，经过一系列复杂的磷酸化过程，产生相应的生物学作用[14-16]。高前应等[17]的实验显示，RPE细胞内PKC转位及其活化与RPE细胞的凋亡及分裂、增生有关。最近的研究显示，Nrf2是细胞内氧化还原稳态关键的调节因子，外源性或内源性氧化应激反应大多是通过Nrf2/Keap1通路来进行调节，在保护细胞氧化应激和损伤中起到重要的作用[18-19]。Zhang等[20]的研究显示，对铅暴露所致的神经细胞氧化损伤中，激活PKC蛋白激酶后，可对Nrf2蛋白磷酸化修饰，诱导Nrf2核转位，启动抗氧化应激反应抵抗氧化损伤。

本实验结果显示，与对照组比较，PMA组和PMA+BST组细胞浆内Nrf2蛋白表达显著减少，而细胞核内Nrf2蛋白表达显著增多，其中PMA组胞浆内Nrf2蛋白表达较PMA+BST组显著降低，而细胞核内Nrf2蛋白表达增多显著，可以证实RPE细胞在给予PKC特异激活剂PMA使PKC特异激活后，经过一系列的级联反应，RPE细胞浆中的Nrf2发生了核转位，使RPE细胞浆内的Nrf2蛋白表达减少，而细胞核内的Nrf2蛋白表达增多。PMA+BST组胞浆和胞核内Nrf2蛋白表达变化的原因可能与Nrf2抑制剂BST预处理RPE细胞后，使Nrf2蛋白分子结构中的丝氨酸/苏氨酸发生了改变，导致PMA对RPE细胞内的Nrf2磷酸化水平降低有关。

综上所述，本研究通过体外培养RPE细胞，应用PKC激动剂和Nrf2阻断剂进行干预，对RPE细胞水平的相关信号通路、功能蛋白及抗氧化标志物进行检测和定位，证实PKC活化能够促进RPE细胞抗氧化能力，其作用机制可能与PKC/Nrf2信号通路调节有关，当PKC信号系统被激活后主要通过磷酸化Nrf2分子上的丝氨酸/苏氨酸，使其与胞浆蛋白伴侣分子Kea1发生解离，导致Nrf2向核内转位，在核内与抗氧化反应元件ARE相结合，促进抗氧化基因GSH表达增强，从而增强RPE细胞的抗氧化损伤的能力。本项研究为AMD的发病机制及临床治疗提供了一个新的理论依据，笔者将在后续实验中通过体内动物损伤模型进一步证实此项理论的可行性，为AMD临床治疗提供新的治疗思路。

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