葡萄酒废酵母中谷胱甘肽的乙醇提取法工艺优化

李双石等

摘要：酵母泥是葡萄酒酿造的主要副产物之一，废酵母泥中富含谷胱甘肽等生物活性物质。通过单因素试验和正交试验，对葡萄酒废酵母中的谷胱甘肽进行乙醇提取法工艺优化，确定最佳提取工艺条件为料液比1∶10.0（m∶V）、乙醇体积分数35%、浸提时间45 min和浸提温度50 ℃，在此条件下谷胱甘肽的得率可高达22.1%。

关键词：葡萄酒废酵母；谷胱甘肽；乙醇提取法；工艺优化

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0658-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.038

Optimization of Extracting Glutathione from Waste Wine Yeast with Ethanol

LI Shuang-shi， ZHANG Hu-cheng， WANG Bo-wei， LAN Rong， LI Bo

（College of Bioengineering， Beijing Electronic Science and Technology Vocational College， Beijing 100029， China）

Abstract： Waste wine yeast enriched in glutathione is one of the main byproducts of industrial wine production. Single factor and orthogonal array design methods were used to optimize the extraction of glutathione from waste wine yeast with ethanol. The results showed that the optimal extraction conditions for obtaining the highest amounts of glutathione were the ratio of raw materials to solution of 1∶10.0（m∶V）， the ethanol volume fraction of 35%， the extraction time of 45 min and the extraction temperature at 50 ℃. Under these conditions， the yield of total glutathione from waste wine yeast was 22.1%.

Key words： waste wine yeast； glutathione； ethanol extraction； process optimization

葡萄酒废酵母是葡萄酒酿造的主要副产物之一，其排放量占葡萄酒产量的4%～5%[1]。葡萄酒酵母泥富含营养物质，将其直接排放，不仅会造成排水的生物耗氧量负荷，而且也会造成很大的资源浪费和环境污染。因此，葡萄酒废酵母的高效再利用引起了国内外学者的关注。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，是一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。GSH具有多种生理功能，如作为抗氧化剂，可保护酶和其他蛋白质的巯基免受氧化，对部分外源毒性物质具有解毒作用，可治疗肝损伤、延缓衰老、增强免疫力等。因此，GSH在临床医学、食品添加剂和化妆品等行业的需求不断增加，具有广阔的市场前景[2]。谷胱甘肽在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内，其中以酵母、小麦胚芽和动物肝脏中含量较为丰富[2]。

目前，关于啤酒废酵母[3-5]、面包酵母[6，7]和玉米胚[8，9]的谷胱甘肽提取工艺研究较多，但利用葡萄酒废酵母提取谷胱甘肽的研究尚未见报道。刘超等[7]分别采用热水、乙醇、盐酸提取面包酵母中的GSH，不同提取方法结果表明，乙醇提取法得到的GSH提取率最高。舒嫒等[4]采用热水和乙醇提取啤酒酵母中的GSH，试验结果表明乙醇提取法虽提取时间较长，但可大大缩短离心和浓缩时间，并且GSH 损失少， 杂质含量较低。因此，本研究以葡萄酒废酵母为原料，采用乙醇提取法制备GSH，并对其提取工艺进行优化，以期为葡萄酒废酵母资源的开发提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

葡萄酒废酵母泥：北京电子科技职业学院葡萄酒中试生产得到，采自2013年11月。

还原型谷胱甘肽标准品，国药集团化学试剂有限公司；5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）：美国Sigma公司。

TDZ4A-WS型低速自动平衡离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；AR5120型天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV-1800PC型紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒废弃酵母GSH醇法提取 将葡萄酒泥与去离子水以1∶1混合（体积比），用60目筛筛分，4 000 r/min离心20 min。重复上述步骤，直至所得沉淀为白色，上清液无色透明为止，收集沉淀，60 ℃鼓风干燥处理，磨粉。精确称取1.000 0 g葡萄酒废酵母放入三角瓶中，加入一定量一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下水浴处理一定时间，冷却至室温，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，得到GSH浸提液。

1.2.2 GSH含量的测定 GSH含量测定采用DTNB法[10]。GSH和DTNB反应生成黄色的5-硫代-2硝基苯甲酸，该物质在pH 8.0、412 nm波长处有最大吸收峰。

标准曲线的制作：取6支比色管，分别加入GSH标准溶液（200 mg/L） 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，补去离子水至0.5 mL，再加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液1.5 mL和3%甲醛溶液0.5 mL，混匀反应2 min，然后加入DTNB分析液2.5 mL，置于25 ℃水浴反应5 min后，412 nm波长下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，GSH浓度C为横坐标， 绘制标准曲线。

浸提液中GSH含量测定：用0.5 mL GSH浸提液代替GSH标准溶液和水的混合物，用同样的显色方法测定浸提液中GSH含量。

1.2.3 单因素试验设计 分别对影响GSH乙醇提取工艺的主要因素料液比、乙醇体积分数、浸提时间和浸提温度进行单因素试验，考察各因素对葡萄酒废酵母GSH提取率的影响。

1）料液比对GSH提取率的影响。称取1.000 0 g葡萄酒废酵母5份，分别加入40%乙醇溶液8、9、10、11、12 mL（m∶V，下同），于50 ℃水浴搅拌90 min，冷却至室温，离心，取上清，检测GSH浓度，计算GSH提取率。

酵母谷胱甘肽提取率=CVn/m×100%

式中，C为粗提液中谷胱甘肽浓度，V为粗提液体积，n为粗提液稀释倍数，m为葡萄酒废酵母干粉质量。

2）乙醇体积分数对GSH提取率的影响。称取1.000 0 g酵母5份，分别加入10 mL 20%、30%、40%、50%、60%乙醇溶液，于50 ℃水浴搅拌90 min，冷却至室温，离心，取上清液，检测GSH含量，并计算GSH提取率。

3）浸提时间对GSH提取率的影响。称取1.000 0 g酵母5份，分别添加40%乙醇溶液10 mL，于50 ℃水浴搅拌30、50、70、90和110 min，冷却至室温，离心后检测上清液中GSH含量，计算GSH提取率。

4）浸提温度对GSH提取率的影响。称取1.000 0 g酵母5份，分别添加40%乙醇溶液10 mL，于30、40、50、60、70 ℃下水浴搅拌5 h，冷却至室温，离心，检测上清液中GSH含量，计算GSH提取率。

1.2.4 正交试验条件优化 根据单因素试验结果确定葡萄酒废酵母多糖提取正交试验的因素和水平，如表1所示。采用4因素3水平的正交试验设计，对葡萄酒废酵母多糖提取工艺进行优化。

2 结果与分析

2.1 GSH含量标准曲线的制作

采用DTNB法测定浸提液中GSH含量，得到GSH浓度C与吸光度A的回归方程为A=0.003 5C-0.004 1（R2=0.996 5），标准曲线如图1所示。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对葡萄酒废酵母GSH提取率的影响 由图2可知，随着料液比的增加，葡萄酒废酵母GSH浸提液中谷胱甘肽含量先缓慢增加，当料液比为1∶10时谷胱甘肽提取率达到最大值，随后又略有降低。这主要是由于当乙醇溶液用量不足时，酵母细胞壁没有充分破碎，导致GSH抽提不完全；但过量的乙醇溶液又容易造成GSH氧化，导致GSH提取率下降。因而，料液比初步确定采用1∶10。

2.2.2 乙醇体积分数对葡萄酒废酵母GSH提取率的影响 乙醇能增强酵母细胞膜类脂的流动性，可提高细胞的通透性，促进胞内物质释放。由图3可知，当乙醇体积分数小于30%时，葡萄酒废酵母GSH提取率随乙醇体积分数增加明显升高。但当乙醇体积分数大于30%时，GSH提取率随乙醇体积分数增加略有下降，这是由于GSH是一种易溶于水和稀醇，微溶于醇的活性肽[7]，乙醇的体积分数较大时反而不利于GSH的提取。因此乙醇体积分数初步确定为30%。

2.2.3 浸提时间对葡萄酒废酵母GSH提取率的影响 由图4可知，浸提时间在50 min时，葡萄酒废酵母GSH提取率最大；超过50 min后，葡萄酒废酵母GSH提取率呈缓慢的下降趋势，这可能是由于GSH在空气中受到氧化不稳定，从而导致含量下降。因此，可初步确定谷胱甘肽浸提时间为50 min。

2.2.4 浸提温度对葡萄酒废酵母GSH提取率的影响 由图5可知，随着浸提温度的升高，葡萄酒废酵母GSH提取率呈先升后降的趋势，在50 ℃时达到最大值。这是由于浸提温度对GSH稳定性有较大影响，GSH的氧化速度与温度呈负相关[7]，高温可破坏GSH的活性；但浸提温度如果过低，也将阻碍乙醇与酵母细胞壁和细胞膜的相互作用，不利于GSH溶出。因此，初步确定50 ℃为葡萄酒废酵母GSH的浸提温度。

2.3 正交试验优化结果

在单因素试验结果的基础上，采用正交试验设计对葡萄酒废酵母多糖提取工艺条件进行优化，试验结果如表2所示。由表2可知，用乙醇提取法制备葡萄酒废酵母中谷胱甘肽的最佳工艺条件为料液比1∶10.0、乙醇体积分数35%、浸提时间45 min、浸提温度50 ℃，此条件下谷胱甘肽的提取率为22.1%。

从表2的极差分析可知，各因素对谷胱甘肽提取的影响程度依次为C、A、D、B，即浸提时间对谷胱甘肽提取率的影响最大，其次为浸提温度和料液比，而乙醇体积分数的影响最小。

3 结论

葡萄酒废酵母中含有丰富的活性物质，谷胱甘肽为其中的一种活性多肽。本试验通过单因素和正交试验对葡萄酒废酵母谷胱甘肽的提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺条件为料液比1∶10.0、乙醇体积分数35%、浸提时间45 min、浸提温度50 ℃，在此条件下谷胱甘肽的提取率可达22.1%。邵伟等[3]、凌秀梅等[5]从啤酒废酵母中提取GSH，GSH提取率较高，分别为23.37%和29%以上，这与原料、GSH检测方法不同有关。乙醇提取法是一种较温和的提取方法，且具有工艺简单、成本低廉、乙醇可回收再利用等特点，因此具有一定的应用前景。

参考文献：

[1] 杜 娜，杨学山，韩舜愈，等.葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分离提取工艺条件优化[J].食品工业科技，2013，34（15）：242-245.

[2] 冮 洁，单立峰.谷胱甘肽的生产及其在食品工业中的应用[J].中国调味品，2009，32（2）：40-44.

[3] 邵 伟，乐超银，唐 明，等.啤酒废酵母中谷胱甘肽提取工艺条件优化研究[J].食品科学，2008，29（5）：173-176.

[4] 舒 嫒，王家骐，朱立江，等.酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究[J].发酵科技通讯，2008，37（3）：16-19.

[5] 凌秀梅，邱树毅，胡鹏刚，等.响应面法优化从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽工艺条件[J].中国酿造，2007（7）：35-38，44.

[6] 陈 娜，乔长晟，胡玉霞，等.面包酵母中谷胱甘肽抽提方法的研究[J].现代食品科技，2008，24（2）：157-160.

[7] 刘 超，袁建国，高艳华，等.酵母还原型谷胱甘肽提取条件的优化[J].食品与药品，2011（7）：234-237.

[8] 王 鑫，徐丽萍，李 旭，等.玉米胚谷胱甘肽提取工艺的研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2009，25（5）：590-592，603.

[9] 徐丽萍，王 鑫，邢 超.溶剂法纯化还原型谷胱甘肽工艺的研究[J].食品工业科技，2011（12）：348-350.

[10] 李从军，谢爱娣.酵母提取液中谷胱甘肽定量测定方法的比较[J].食品与发酵工业，2010，36（7）：158-162.