补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1/Smad3表达的影响*

叶 蕾 余亚平 陈芝芸 严茂祥 何蓓晖 蔡丹莉

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

肝纤维化是肝脏慢性炎症反复的结果，其特点是细胞外基质(ECM)合成与降解失衡导致其在肝脏内过度沉积[1]。在细胞和分子水平，这一过程主要表现为肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）活化和转化生长因子-β（Transforming growth factor-beta，TGF-β)及其下游信号分子异常激活；Smads蛋白为TGF-β信号最重要胞内效应因子，介导其核内外的信号转导，并调节TGF-β家族的正、负反馈[2]。补肾化瘀方是笔者临床治疗肝纤维化的经验方，以往研究[3]表明，该方能抗肝纤维化、改善肝组织炎症和肝功能的作用,本研究探讨补肾化瘀方对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及其Ⅰ受体、Smad3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SD大鼠30只，雄性，SPF级，体重140±10g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[许可证号：SCXK（沪）2013-0016]。

1.2 补肾化瘀方制备：由仙灵脾、党参、积雪草各15g，黄精20g，女贞子、郁金各12g，虎杖24g，丹参30g等组成，浙江省中医院制剂中心制成4.4g/ml的流浸膏。

1.3 主要试剂及仪器：CCl4由上海凌峰化学试剂有限公司提供；TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript™ RT Master Mix(Perfect Real Time)及SYBR® Premix Ex Taq™ II(TliRNaseH Plus)由宝生物工程（大连）有限公司提供。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、TGF-β1兔单抗为美国Abcam公司产品，Smad3鼠单抗为美国Santa Cruz公司产，超敏酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。AB17900PCR扩增仪为美国ABI公司产品，Nikon eclipse 80i光学显微镜为日本Nikon公司产品。

1.4 实验方法：30只大鼠适应性喂养1周后随机分为正常组、模型组、补肾化瘀方组共3组，每组10只。模型组和补肾化瘀方组以橄榄油稀释的40%CCl4皮下注射，0.3ml/100g，首剂加倍，2次/周，共6周；正常组以等容量橄榄油皮下注射代替；同时补肾化瘀方组每天灌服4.4g/ml的补肾化瘀流浸膏1ml/100g，正常组和模型组则每天以等容量的生理盐水灌胃，均连续6周。于末给药次当晚禁食不禁水16h，次日空腹麻醉下处死，收集肝脏标本，部分存于-80℃用于荧光定量PCR检测，部分肝右叶组织10%中性甲醛中固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用于免疫组化检测。肝组织α-SMA、TGF-β1及其Ⅰ型受体[TGF-β receptorⅠ（TβRI）]、Smad3等基因mRNA表达采用实时荧光定量PCR检测，以β-actin为内参，相对表达量（2-△△Ct）表示目标基因表达量，引物由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成。引物基因序列见表1。

表1 引物基因序列

肝组织α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表达采用免疫组化检测。结果判断：α-SMA阳性细胞表现为胞浆呈棕黄色，少部分膜表达；TGF-β1阳性细胞为胞浆呈棕黄色；Smad3阳性细胞表现为胞浆/核呈棕黄色；以阳性细胞着色程度和范围进行半定量[4]。

1.5 统计学方法：采用SPSS21.0软件进行数据统计分析，计量资料以±s表示。行正态性检验，非正态分布资料转换成正态分布，采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ和Smad3基因mRNA表达的影响：模型组大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3三者mRNA表达较正常组显著上调（P＜0.01），应用补肾化瘀方干预后，肝组织上述基因mRNA表达较模型组明显下调（P＜0.05,P＜0.01），见图1。

图1 肝组织α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3mRNA的表达（±s,n=10）

2.2 补肾化瘀方对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ、Smad3蛋白表达的影响：模型组大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表达水平较正常组明显增强（P＜0.01），补肾化瘀方组组大鼠肝组织α-SMA、TGF-β、Smad3的表达较模型组不同程度下降（P＜0.05,P＜0.01），见表2。

表2 补肾化瘀方对肝组织α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表达的影响（±s,n=10）

表2 补肾化瘀方对肝组织α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表达的影响（±s,n=10）

Smad3 0.80±0.75 3.85±0.97**2.35±0.71**#分组正常组模型组补肾化瘀方组α-SMA 1.40±0.52 4.65±1.38**3.00±0.82**#TGF-β1 1.10±0.74 5.10±1.20**2.70±0.92**##

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 讨论

ECM主要来源于HSC，HSC激活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化形成的核心。TGF-β1作为最重要的促HSC活化的细胞因子，由肝巨噬细胞、肝窦内皮细胞等合成分泌，激活HSC，同时能促进HSC自分泌、旁分泌TGF-β1，产生自我增殖的循环过程，活化临近HSC大量合成胶原[5]。细胞外TGF-β1与细胞表面TβR相互结合，能够激活其下游的信号转导分子smad2/3/4蛋白，形成复合物，最终转移入细胞核，直接或参与调节因子形成转录复合子，以诱导目的基因的转录表达[6]；因此有研究认为，抑制TGF-β1的表达和TGF-β/smad信号通路的激活，是阻断肝纤维化的关键[7]。

补肾化瘀方由仙灵脾、黄精、女贞子、党参、虎杖、郁金、丹参、积雪草等组成，具有补肾益气，化瘀解毒等功效[3]。本研究发现，肝纤维化模型大鼠HSC活化标志物α-SMA mRNA和蛋白表达均较正常组明显上调，TGF-β、TβRⅠ、Smad3的表达也较正常组显著增强；而补肾化瘀方干预后能抑制上述关键分子mRNA和蛋白的过表达，提示模型大鼠肝组织HSC活化，TGF-β1/Smad3信号通路激活，补肾化瘀方能降低肝组织中TGF-β1、TβRⅠ及其信号转导分子Smad3的mRNA及蛋白表达水平，从而抑制HSC活化增殖、抑制TGF-β1通过信号转导分子Smad3促肝纤维化的作用。