OLYMPUS生化分析仪检测尿mALB时后带现象预警参数设置的研究

肖子衿 ，李永杰 ，王伶

(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006；2、江西师范大学附属中学，江西 南昌 330003；3、新余市渝水区人民医院，江西 新余 338000)

免疫比浊法是将免疫反应引入生化检测领域而形成的生化－免疫联合应用技术，它同时具备生化检测的快速和免疫分析的高敏感、高特异性，是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应的方法，可对各种液体介质中微量抗原、抗体和药物以及小分子半抗原物质进行定量测定[1]。生化分析仪中应用免疫比浊法对尿微量白蛋白浓度进行测定时，过量m－ALB在反应中出现后带现象[2，3]，导致检测结果出现偏差、临床误判，所以，通过在生化分析仪上设置正确的预警参数，使其在检测m－ALB时出现的后带现象时给出报警[4，5]。本研究通过对一系列高低浓度的尿微量白蛋白（mALB）进行测定，研究分析不同浓度标本时间－吸光度曲线和剂量－最终吸光度曲线的变化趋势，探讨奥林帕斯全自动生化仪尿m－ALB测定时后带现象的预警参数设置方法。

1 材料和方法

1．1 材料 mALB高浓度样品来自本院患者，离心尿液后置－20°C冰箱内保存备用，mALB低浓度样品来自试验当天本院健康体检者。

1．2 仪器与试剂

1．2．1 仪器Beckman AU5800全自动生化分析仪

1．2．2 试剂mALB测定试剂盒（免疫比浊法）及校准品。当天质控在控，当年室间质评PT成绩为100。

1．3 方法

1．3．1 主要上机检测参数参照m－ALB试剂说明书设置

1．3．2 mALB最大稀释倍数和临床可分析范围的确定 分析测量范围确认方法参考（CLSI）的EP6－A的文件[6]，取一份高浓度标本，样本用生理盐水进行系列稀释， 稀释倍数分别为 3、5、10、20、50、100倍，每个样本浓度重复测定3次，取样本稀释后得出的平均结果为检测值，检测值乘以稀释倍数与原倍结果进行比较，计算各稀释倍数的实测偏倚，实测偏倚应在 0．9～1．1 范围内。

1．3．3 系列稀释浓度梯度的mALB样本配制与测定 将收集入院患者高浓度mALB样本5份，使用生理盐水进行稀释重复测定3次取平均结果(5份样 本 浓 度 分 别 如 下 ：736．5μg/L、2106．9μg/L、2975．7μg/L、4882．9μg/L、24978．5μg/L)；将上述高浓度 标 本 配 制 成 41．67、208．34、340．7、416．67、625．01、1008．37、1176．43、1344．49、1680．62、1782．7、1910．03、2250．37、2790．33、3631．5、6886．91、9838．44μg/L 共 16 个浓度梯度。 将系列稀释浓度标本进行编号（标本1、标本2……标本16）并上机检测，每个标本测定3次取平均值，记录系列浓度标本各监测点吸光度、试剂空白对照与最终吸光度。根据最终吸光度峰值（标本13）的标本浓度，再对该峰值附近浓度进行配置，配置浓度为1737．55、1848．68、1941．97、2016．74μg/L， 标本编号为：标本 17、标本 18、标本 19、标本 20，记录该 4个浓度标本各监测点吸光度、试剂空白对照与最终吸光度。

1．3．4 mALB剂量－最终吸光度曲线分析 将上述记录的20个标本的最终吸光度与标本浓度绘制成剂量－最终吸光度曲线，确定剂量－反应曲线的平衡点（吸光度峰值对应的浓度，即拐点处）。

1．3．5 系列浓度标本时间－吸光度曲线分析 奥林帕斯全自动生化仪采用0～27读点共28个监测点进行反应监测，每个间隔点时间为19s，在0读点前加入试剂1（R1），在0～1读点间加入样本，在10～11读点间加入试剂2（R2）。将上述记录的20个标本各监测点吸光度与试剂空白对照相减，所得差值乘以10000后与样本各监测点绘制时间吸光度曲线，观察系列浓度标本反应曲线的变化趋势。

2 结果

2．1 mALB最大稀释倍数的确认 使用生理盐水进行系列稀释 3、5、10、20、50、100 倍的实测偏倚分别为 9．5%、1．68%、3．47%、6．78%、25．07%，100 倍稀释不在10%范围内，所以mALB最大稀释倍数为50倍，由于检测的线性范围是0－300μg/L，因而临床可报告范围为 0－15000μg/L。

2．2 mALB剂量－最终吸光度曲线分析mALB剂量－最终吸光度曲线如图1所示，标本最终吸光度随着浓度的升高，其吸光度也在升高，一直到标本18（1848．68μg/L）达到峰值，即 mALB 剂量－最终吸光度曲线平衡点浓度为1848．68μg/L，在平衡点浓度之前，吸光度随着浓度的增加而增加，在平衡点之后，吸光度则开始降低。

图1 mALB剂量-最终吸光度曲线

2．3 系列浓度标本时间－吸光度曲线分析 系列浓度标本时间－吸光度曲线如图2所示，一系列浓度标本时间－吸光度曲线都随着时间的增加而增加。于监测点10～11之间加入R2之后，各标本在监测点11～27之间的时间－吸光度曲线均开始上升，后续反应过程曲线较平滑。随着反应浓度的增加，吸光度曲线并不继续升高，标本浓度越高，前期曲线增长越快，后期则逐渐趋近平滑，抗原过量的后带效应也越来越明显。

图2 mALB时间-吸光度曲线

2．4 抗体过量的参数设置通过对mALB剂量－最终吸光度曲线与系列浓度标本时间－吸光度曲线研究分析，选择15读点到11读点差值与27读点到11读点差值的比值＞0．6000，并且27读点到11读点差值＞0．0716作为抗原过量的判断标准。各浓度读点差值的比值见表1。当mALB浓度小于或等于标本 3（340．7μg/L），各浓度读点差值的比值=＜0．6000 或读点 27 到读点 11 差值=＜0．0716 时，仪器不发生报警；当mALB浓度大于标本3（340．7μg/L），各浓度读点差值的比值＞0．6000且读点27到读点11差值＞0．0716时，仪器提示后带效应并产生报警。

2．5 后带现象预警参数的设置 根据一系列mALB浓度的剂量－最终吸光度曲线和时间吸光度曲线，对AU5800进行后带预警参数的设置，进入首页－菜单列表－参数－其他，选择数据检查参数，出现逻辑检查1，2，3。进入编辑状态，选择逻辑检查1，测试名称选择mALB。逻辑检查1中有检查点1，2，3，用于读点的数值计算，分别输入 11，15，27。逻辑检查1中的判定值1，2，3则需要符合0．0=＜判定值 1=＜2．0，判定值 1=＜判定值 2=＜9．0，0．0=＜判定值 3=＜3．0，分别输入 0．6000，9．000，0．716。 极限点1，2是设置检查点之外的判定点，输入11，27。检查类型选择类型1，其意味着应用判定公式1和2，即公式1和2都满足。公式1：判定值1=＜OD(检查点2－检查点1)/OD(检查点3－检查点1)=＜判定值 2，公式 2：判定值 3=＜(极限点 2－极限点 1)。见图3完成检查参数的设置，参数设置完成后，采用不同mALB浓度样品进行结果验证，mALB浓度超过340μg/L的样品基本都能成功识别，样品数值变红，并产生报警提醒（Z）见图4，有效的避免检测结果的偏差。

表1 不同浓度mALB样品抗原过量检查参数判定值

图3 Olympus5800系列尿微量白蛋白检查参数的设置

图4 高浓度样本的报警验证

3 讨论

免疫比浊法的基本原理是当抗原与抗体在稀释系统中反应比例适当时，形成的免疫复合物在沉淀促进剂的作用下，于液相中形成微粒，并产生浊度，当抗体过量且固定时，溶液中待测抗原的浓度在一定范围内与免疫复合物的生成量成正比[2]。抗原、抗体剂量反应曲线是由Heidel berger于1929年首次发现[7，8]，在抗体过量阶段，沉淀物的量随着抗原浓度成比例增加，当抗原浓度的增加不再增强信号时，就达到了平衡点，进一步增加抗原的量会导致沉淀总量的减少。因此当其出现在生化分析仪检测上时，将使检验结果产生较大误差，影响临床诊断与治疗[8]。在临床实际工作中，用手工或仪器对样品进行前稀释，也可解决钩状效应的问题，但这方法有时会导致抗原含量远远低于抗体含量，手工或仪器前稀释也会增加工作量和试剂成本[9，10]。

根据图1mALB剂量－最终吸光度曲线和图2mALB时间－吸光度曲线变化关系可知，mALB检测方法对高剂量浓度标本存在着明显的后带效应[11]。图1 显示，标本 18（1848．68μg/L）的浓度值为曲线的峰值（最终吸光度随着浓度增长转而下降），随即认为标本18浓度为钩状效应的拐点，但从图2曲线变化可知，在曲线的峰值标本18（1848．68μg/L）的浓度值之前，即标本 3（340．7μg/L）开始时间－吸光度曲线一直处于上升的趋势，曲线的间隔已经越来越小。因此，通过在奥林帕斯生化仪检测尿微量白蛋白中设置后带现象预警参数来有效识别反应体系中的后带现象是非常重要的[12]。

通过图2可知，当反应体系中mALB抗原含量固定，加入超敏化的mALB抗体过剩时，前期吸光度与试剂空白的差值上升速率较快，待mALB抗原与mALB抗体结合较多后，上升速率增加不明显。当我们通过分析图1可知，最终吸光度和吸光度与试剂空白的差值是不一样的，通过特定公式进行转换，标本 18（1848．68μg/L）的浓度值达到反应曲线的峰值，即标本浓度在1848．68μg/L之前时一直处于正反应状态，在1848．68μg/L之后则会出现下降的趋势。由此可知，在设置后带现象预警参数时，正确认识与理解时间、浓度、吸光度之间的变化特点是成功设置的前提。

免疫比浊法中钩状效应预警参数的设定都是从反应曲线入手。刘忠民[13，14]等人以IgG为例，通过分别分析抗体过剩与抗原过剩反应曲线，选择20读点的反应完成率来设置预警参数。在本研究中，不论抗体过剩还是抗原过剩，其时间－吸光度反应曲线都是一直上升的，当样本中mALB抗原浓度不断增加时，其28个读点的吸光度都会随之不断变化，各浓度标本读点之间差值的比值却在不断上升。腾晓梅[15]则直接对超过测量范围极限值上限的标本进行稀释测定，但本文中图2显示，标本 20（9838．44μg/L）的实际浓度远远超过测量范围的上限，但当标本20上机测定时，因最终吸光度较低，仪器显示标本20的浓度为664μg/L，表明高浓度标本由于后带效应导致最终吸光度反而较低，使得测定值较小。

本试验mALB的检测方法应用免疫比浊法，使mALB抗体与标本中mALB抗原结合。通过观察mALB时间－吸光度曲线和mALB剂量－最终吸光度曲线的变化，最终选择15读点到11读点差值与27读点到11读点差值的比值＞0．6000，并且27读点到11读点差值＞0．0716作为抗原过量的判断标准来识别反应体系中存在的后带效应。如反应体系中存在后带效应，仪器则出现报警提示，工作人员对标本进行手工合理稀释重测。

4 结论与展望

综上所述，免疫比浊法用于mALB检测时一直受到“后带效应”的干扰，导致临床误判，因此设置后带效应报警提示具有非常重要的临床价值。本研究针对奥林帕斯检测mALB产生后带现象预警基本达到要求，随着技术的发展，钩状效应预警参数的应用将会越来越广，研究同一类型的生化分析仪对不同检验项目设置预警参数则需要我们不停的探索。