基于几何形态学对二囊亚属三种库蠓翅形的变化分析(双翅目：蠓科：库蠓属)*

段 琛 常琼琼 罗 娅 周焕飞 侯晓晖

(遵义医学院， 贵州遵义 563000)

库蠓属Culicoidesa隶属于双翅目Diptera、蠓科Ceratopogonidae，目前在全世界共发现1 415种库蠓(Borkent, 2016)，我国库蠓已知348种(Changetal., 2017)，库蠓是一类重要的媒介昆虫(张海林等, 2012)，能够传播多种疾病，如人类的奥柔普西病毒病(Robertsetal., 1981; Carpenteretal., 2013)、牲畜的蓝舌病、非洲马瘟、牛流行性出血热、水泡性口炎等(王飞鹏等, 2012)。库蠓的形态分类是研究蠓传疾病的基础，其分类鉴定主要是根据小眼面间柔毛有无、复眼是否分离、触角感受器分布等特征，在亚属到种的鉴定过程中最关键的特征是翅斑分布情况，如二囊亚属中南山库蠓C.lansangensis、长喙库蠓C.longirostris、连斑库蠓C.jacobsoni三种库蠓除了具有该亚属的共有特征外，其小眼面间均无柔毛、翅斑较为明显、中4室及径5室的淡斑分布也较为接近，传统分类鉴定较难区分。因此，单纯依靠传统的形态学鉴定很容易混淆。近年来，几何形态学(Geometric morphometric)的逐渐发展与广泛应用，为昆虫分类学研究提供了更多的可能性(Zelditchetal., 2012)。几何形态学将生物形态形状(form)、大小(size)、物理性能(physical property)等因素抽离，只留下形状变异单因素，并通过地标点(landmark)，将研究对象的结构转化为笛卡尔坐标系中的点阵，从而根据地标点所提供的形状信息，来实现对不同生物机体的种间与种内微小结构差异的量化分析(白明等, 2009; Mitteroeckeretal., 2009)。因此，几何形态学在近似种的研究中有着明显的优势。国内可见李玲等(2017)运用几何形态学对离腹寡毛实蝇属的3种实蝇翅脉进行了分析，发现3种实蝇的翅脉变异主要发生在翅端的第5径室、第2中室，为实蝇分类提供了更多的依据。温光华等(2015)使用几何形态学对5种稻蝗前后翅进行了形态变异的分析，发现在前翅的缘前脉域、前缘脉域和臀脉域及后翅的亚前缘脉域、前缘脉域和轭脉域的变异位点都可以作为稻蝗物种的分类特征。而库蠓属的几何形态学研究在国内却鲜有报道。本研究通过几何形态学来分析在我国分布的库蠓属二囊亚属3种库蠓(南山库蠓、长喙库蠓、连斑库蠓)的翅脉变异情况，以期找出近似种间主要的变异部位，为库蠓的近似种分类研究提供更有效的方法。

1 材料与方法

1.1 标本整理及图像获取

本研究所用标本为研究组馆藏标本以及外单位馈赠标本，标本经侯晓晖和刘国平老师鉴定，具体信息见表1。本研究选取翅面完整且无褶皱的3种库蠓玻片，共计33张，即南山库蠓C.lansangensis11张(编号为N1～N11)、长喙库蠓C.longirostris7张(编号为C1～C7)、连斑库蠓C.jacobsoni15张(编号为L1～L15)。利用OLYMPUS BX43显微镜和DP26照相机对所有库蠓标本进行拍照，并保存所有个体的翅图。

表1 供试库蠓相关信息Tab.1 Information of the Culicoides in this study

1.2 数据提取及标准化处理

用tpsUtil 1.6将翅形图片格式文件转化为TPS格式文件，然后用tpsDig2分别对3种库蠓的翅进行地标点(Landmark)，所有标点都选择在翅脉稳定的交叉点或转折点，每张图片的地标点位置、顺序一致且标点数目相同，都为13个(图1)，使用tpsSmall 1.2对3种库蠓翅原始数据集进行内部的相关性检验，并使用广义普氏分析法(Generalized procrustes analysis, GPA)进行普氏叠加(Procrustes superimposition)，排除原始坐标值包含的非形状因素。

图1 翅的13个地标点及翅脉Fig.1 Landmarks and veins on the wing of CulicoidesArc: 弓脉；M，M1，M2: 中脉，中1脉，中2脉；R: 径脉；R-M: 径中横脉；r1, r2: 径1室和径2室；Cu, Cu1, Cu2: 肘脉，肘1脉，肘2脉。Arc: Arculus; M, M1, M2: Medial and branches; R: Radial; R-M: Radial-median crossvein; r1, r2: First and second radial; Cu, Cu1, Cu2: Cubital and branches.

1.3 数据统计与分析

根据上述所取的地标点数据，对3种库蠓的翅进行主成分分析(Principal components analysis，PCA)来比较种间的差异。利用薄片样条法(Thin plate spline，TPS)来分析地标点的差异，通过网格轮廓图来展示3种库蠓翅脉上的差异。通过典型变量分析(Canonical variate analysis, CVA)，辅以马氏距离(Mahalanobis distance)和普氏距离(Procrustes distance)及其差异显著性比较来展现其结果。此外，本研究还运用NTSYS-pc 2.10e软件进行聚类分析，用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)构建聚类图来探讨3种库蠓之间的翅脉、翅形的相似关系。

2 结果

2.1 三种库蠓的形态特征比较

本研究中南山库蠓C.lansangensis、长喙库蠓C.longirostris和连斑库蠓C.jacobsoni三种库蠓利用形态学特征来区分比较困难，尤其是三者小眼面间均无柔毛、翅斑较为明显、中4室及径5室的淡斑分布也较为接近(表2、图2)。

2.2 三种库蠓翅的主成分分析

根据地标点信息，对3种库蠓的翅进行主成分分析。共获得22个主成分(Principal component，PC)，其中第1主成分(PC1)占总变异量的44.98%，第2主成分(PC2)占总变异量的18.30%，第3主成分(PC3)占总变异量的10.62%，前3个主成分的特征值占总变异量的73.89%，能够说明3种库蠓翅的主要差异。如图3散点图所示，根据3种库蠓在PC1和PC2及PC3正负轴的分布状况可以得出在三者之中连斑库蠓翅的种内变异较大，而长喙库蠓翅的种内变异较小。在PC1轴上，长喙库蠓介于南山库蠓和连斑库蠓之间；在PC2轴上，南山库蠓与连斑库蠓较为接近，而长喙库蠓距离两者较远；在PC3轴上，三者均较为接近。因此，在PC1和PC2散点图上可以看出3种库蠓均能较好分开，连斑库蠓和长喙库蠓虽有交集，但无点的交叉，而在PC1和PC3的散点图中，南山库蠓与长喙库蠓则有部分点的交集。

表2 本研究中3种库蠓形态特征对比Tab.2 Comparison of morphological features of three Culicoides in this study

图2 本研究中3种库蠓的一侧翅图Fig.2 The wing of three Culicoides in this studyA. 南山库蠓C. lansangensis；B. 长喙库蠓C. longirostris；C. 连斑库蠓C. jacobsoni.

结合图3中网格轮廓图的扭曲状况可知，在PC1轴上，翅的变异主要发生在径1室和径2室内(标点4到5、6)以及中肘叉到肘1脉端部和中2脉的区域(标点11到10、8)，表现为径1室和径2室区域呈明显缩小趋势，而中4室和中2室端部则整体呈外展趋势。在PC2轴上，变异区域主要发生在径2室到径5室内(标点4到6、7)以及中肘叉到肘1脉端部的区域(标点11到10、9)，表现为径1室和径2室向径中横脉方向缩小，而中4室呈现出外展的趋势。在PC3轴上，翅的变异主要发生在中4室内(标点11到10、9)以及径5室(标点5、6到7)，表现为径5室呈外展趋势，而中4室向四周扩展。因此，3种库蠓翅的差异主要集中于径1室、径2室、径5室区域以及中2室近端部、中4室内。

2.3 三种库蠓翅的聚类分析

用3种库蠓翅的形态数据进行聚类分析，获得3种库蠓翅型及翅脉的相似性关系(图4)。在距离系数为0.07时，长喙库蠓和南山库蠓聚在一起，而连斑库蠓单独成为一支，说明南山库蠓和长喙库蠓翅的形态相似性较高。

2.4 三种库蠓翅的形态变异

在主成分分析的基础上，通过典型变量分析(CVA)来探讨种间翅的形态变异，如图5所示，3种库蠓不同个体均聚在一起。针对3种库蠓的形态变异距离进行统计学分析(表3)，3种库蠓的翅型两两之间均具有显著差异(P<0.05)，且南山库蠓与长喙库蠓的马氏距离仅11.6676，说明两者的翅型差异最小，而连斑库蠓与长喙库蠓的马氏距离为14.9147，说明两者的翅型差异最大，这与聚类分析结果一致。

图3 三种库蠓翅第1 主成分和第2、3主成分的散点图及网格轮廓图Fig.3 The scatter plots of PC1 and PC2, PC3 for wing and outline variation of three Culicoides

图4 基于普氏距离的3种库蠓翅形态聚类分析Fig.4 Phenetic tree of wings of 3 different Culicoides based on the Procrustes distance

表3 3种库蠓翅普氏距离及马氏距离的显著性比较(基于10 000 次重复)Tab.3 Shape difference of wing of three Culicoides based on the Procrustes distance/ Mahalanobis distance and significant test (based on 10 000 permutation rounds)

图5 3种库蠓种间翅形状典型变量分析散点图Fig.5 The scatter plots of Canonical variate analysis of three Culicoides

3 讨论

目前，国外已有利用几何形态学方法解决库蠓近似种的分类问题，如Muoz-Muoz(2011)将几何形态学与分子研究相结合对库蠓亚属的灰黑库蠓种团(Pulicarisgroup)进行研究，结果发现几何形态学能够对其进行区分，以及针对库蠓属二囊亚属不显库蠓种团(Obsoletusgroup)的研究发现丘夫库蠓(Culicoidesdewulfi)应该踢出此种团，且提出同种不同地理种群的翅形差异变化并不大(Muoz-Muozetal., 2014)。鉴于上述工作，本研究针对南山库蠓、长喙库蠓、连斑库蠓三种库蠓翅的形态变化进行几何形态学分析研究，发现3种库蠓的翅型有明显差别，通过CVA分析、聚类分析等显示长喙库蠓与南山库蠓的翅型较为接近，而连斑库蠓与两者的翅型差异较大。进一步证实，几何形态学方法在库蠓属近似种的分类鉴定中是十分有效的。

虽然库蠓翅的大小也存在一定的变异，但其受环境因素影响较大，如温度、各个时期的营养状况以及幼虫的在土壤中的密度等(Smithetal., 2003; Jirakanjanakitetal., 2007)。因此，本文主要探讨了库蠓近似种的翅形变化，根据以往研究发现，翅形的变化较为稳定，且在不同种间差异较大，这可能与翅脉的变化或者基因水平的变异有一定的关系(Birdsalletal., 2010)，但其变异具体与哪些基因以及翅脉走向相关尚且不得而知，需要进一步深入研究。

本研究中薄板样条分析(TPS)显示3种库蠓的翅形变化区域主要集中在径1室、径2室及中4室，这为今后的分类鉴定提供更多可参考的依据，即根据这些部位的差异作为形态鉴定的补充。此外，在库蠓分类研究中也可以通过寻找库蠓翅的主要变异位点，从而建立起形态分析数据库，借助对所获标本地标点数据的比对，进行种类鉴定，为库蠓的自动鉴定系统开发提供了可能。