用蒽酮-硫酸比色法测定经澄清剂精制后一贯煎中多糖含量的可行性分析

白 兰，郑 宇

（1.四川省医学科学院·四川省人民医院，电子科技大学附属医院·四川省人民医院，个体化药物治疗四川省重点实验室，四川 成都610072；2.成都中医药大学，四川 成都 610075）

一贯煎[1]是清朝魏之琇发明的滋阴疏肝名方。该方是治疗阴虚肝郁、肝胃不和所致脘胁疼痛的常用药方。现代中医常用一贯煎治疗慢性肝炎、慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡、肋间神经痛、神经官能症等。研究发现，一贯煎处方中的生地黄、枸杞、北沙参、当归、麦冬均含有多糖成分[2]，且一贯煎的临床药理作用与其所含的多糖成分有关[3，4]。因此，对一贯煎中多糖的含量进行测定具有重要的临床意义。本次研究主要探讨用蒽酮-硫酸比色法测定经澄清剂精制后一贯煎中多糖含量的可行性。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

本次实验使用的仪器是UV1700型紫外分光光度仪（日本岛津公司生产）、BP 211D 型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius 公司生产)、超声清洗器、水浴锅及制冰机等。

1.2 实验试剂

本次实验使用的试剂是D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所生产，批准文号：110833-201205）及苯酚、硫酸。

2 实验方法

2.1 制备一贯煎样品溶液的方法

按照一贯煎的处方称取药材，加10倍的清水煎煮2次，每次煎煮1.5 h，对所得药液进行滤过处理。将两次煎煮所得的药液合并在一起，制作成浓缩液以备用（药材与药液体积的比值为1:1）。将浓缩液按照1:8的比例稀释后，放到温度为80℃的恒温水浴中进行搅拌。将稀释后的浓缩液平均分为A组和B组。在A组浓缩液中加入浓度为2%的ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型。120 min后，在B组浓缩药液中加入浓度为4%的ZTC 1+1天然澄清剂Ⅲ型。对两组稀释后的浓缩液持续搅拌30 min后，将其放到温度为4℃的环境中静置24 h，并进行滤过处理，将滤液浓缩至药材与药液体积的比值为1:1时即得经澄清剂精制后的一贯煎样品溶液。

2.2 制备对照品溶液的方法

精密称取104.8 g 的D-无水葡萄糖标准品，将其放到容量为100 ml的量瓶中，用蒸馏水将其稀释至刻度后摇匀，即得浓度为1.048 mg/ml的对照品溶液。

2.3 制备供试品溶液的方法

精密量取0.5 ml的一贯煎样品溶液，将其放到容量为100 ml的量瓶中，用蒸馏水将其稀释至刻度后摇匀。再精密量取0.1 ml的一贯煎样品溶液，将其放到容量为25 ml的刻度试管中，按照2.1中的方法进行操作，即得供试品溶液。

3 实验结果

3.1 进行线性关系实验的结果

分 别 精 密 量 取 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml的对照品溶液，将其分别置于容量为25 ml的刻度试管中，并分别加入适量的蒸馏水，使其达到2.0 ml。然后在刻度试管中分别加入6 ml的蒽酮试液（用浓度为80%的硫酸将0.1 g的蒽酮稀释至100 ml，现用现配）。将刻度试管放到涡旋振荡机中处理。然后将刻度试管放到沸水浴中加热15 min。取出刻度试管后，立即将其置于冰水浴中冷却15 min。使用同样的方法将2 ml的蒸馏水制作成空白对照溶液。将这两种溶液放到UV1700型紫外分光光度仪中进行紫外分光扫描，进行紫外分光扫描的波长为627 nm，以测定这两种溶液的吸光度。将吸光度(Y)作为纵坐标，将D-无水葡萄糖的浓度(X)作为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=1.669X-0.1431（r=0.9989）。结果表明，D-无水葡萄糖的测定量在0.2096～1.2576 mg／L范围内时的线性关系良好。

3.2 进行最大吸收波长实验的结果

将对照品溶液和供试品溶液放到UV1700型紫外分光光度仪中进行紫外分光扫描。进行紫外分光扫描的波长为500～700 nm。结果显示，在进行紫外分光扫描的波长为627 nm时有最大的吸收波长且无干扰。详情见图1。

图1 对照品溶液（左）与供试品溶液（右）的波长扫描图

3.3 进行精密度实验的结果

取0.4 ml的对照品溶液，对其进行6次吸光度实验。结果显示，对照品溶液的平均吸光度为0.447，其RSD=0.38%。说明该测定法的精密度良好。

3.4 进行重复性实验的结果

取同一批次的6份样品，按照2.3中的方法制备供试品溶液，对供试品溶液进行重复性实验。结果显示，供试品溶液中多糖的平均含量为0.7786 g/ml，其RSD=1.9%，说明此法的重复性良好。

3.5 进行稳定性试验的结果

取重复性实验项下的1份供试品溶液，在同一条件下，分别在第0 min、第10 min、第20 min、第30 min、第40 min、第60 min时进行检测，记录并计算供试品溶液的峰面积。结果显示，供试品溶液的RSD=0.8%。说明供试品溶液在常温条件下放置60 min的稳定性较好。

3.6 进行加样回收率实验的结果

精密量取同一批次6份0.05 ml的一贯煎样品溶液，将这些样品溶液分为三组，分别加入0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml的对照品溶液。按照2.3中的方法制备供试品溶液。对所得的供试品溶液进行回收率实验。结果显示，三组供试品溶液的平均回收率为97.50%、99.52%、99.47%。详情见表1。

表1 对一贯煎样品溶液进行回收率实验的结果

3.7 进行多糖含量实验的结果

精密量取三批一贯煎样品溶液各0.5 ml，按照2.3中的方法制备供试品溶液，测定这三批供试品溶液中多糖的含量。结果显示，这三批供试品溶液中多糖的含量分别为0.897 g/ml、0.815 g/ml、0.933 g/ml。

4 讨论

研究发现，采用蒽酮-硫酸比色法基本可以测定中药复方制剂中所有碳水化合物及寡糖类、多糖类的含量[5]。中药复方制剂中的有效成分较多且结构较为复杂，导致难以对其中的多糖成分进行定量检测。对中药复方制剂中的多糖成分进行定量检测，需建立在提取、分离纯化、纯度分析、组分分析等一系列前期工作的基础上。目前，灵芝、香菇、石斛等中药中的多糖已经可以通过分离、精制、纯化等操作进行处理，常用的定量检测方法是蒽酮-硫酸比色法。笔者相信，随着我国中药成分提取技术及分析技术的不断进步，该方法的临床应用会越来越广泛。