丛枝菌根真菌强化高粱幼苗修复锶污染土壤的研究

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(1. 河南科技大学农学院，洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室，河南 洛阳 471023；2.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学 农业农村部草牧业创新重点实验室,兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020；3.甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州 730070)

放射性核素锶-90(90Sr)形成于核武器和核反应堆爆炸，为235U和239Pu的裂变产物[1]。90Sr的半衰期为28.79年，为β辐射体，是一种重要的长寿命、高毒类核素[2]。90Sr能够造成重金属和放射性双重污染，不能被生物降解，一旦释放到环境中，90Sr就会在土壤中富集积累，被植物根部吸收后进入植物体内，再通过食物链进入人体，进而对人体造成危害。90Sr属于碱土元素，其化学形态与钙元素非常相似，可沉积在含钙的骨组织中并滞留多年，对人体的危害极大[3]。随着我国核工业的发展、铀矿勘探和开采活动增加，尤其是退役铀矿逐渐积累, 放射性核素污染土壤的治理与修复问题引起了人们的重视[4]。截至2017年底，西北处置场累计接收放射性废物共13857.74 m3，总活度为5.67×1014Bq。北龙处置场累计接收大亚湾核电厂和岭澳核电厂产生的放射性废物包总体积为2291.24 m3，总活度为7.95×1013Bq[5]。面临不容乐观的放射性核素土壤污染的总体形势，开展90Sr污染土壤的修复研究很有必要。研究表明放射性核素在环境中与其稳定性同位素在环境中的行为相似[6]。因此，观察稳定锶-88在土壤和植物中的行为，是一个预测模拟其放射性同位素锶-90的方法。

植物修复是利用植物根部吸收和富集污染土壤中的重金属，并转移至地上部分，在不破坏土壤结构的基础上从土壤中清除重金属[7]。植物修复技术以其费用低、环境友好等特点被广泛应用于重金属污染土壤的治理工程中。Prasad等[8]比较了植物修复3H、235U、239Pu、137Cs和90Sr污染土壤的效果，结果显示富集核素的能力与植物类型有关。谷类作物富集90Sr的浓度相差2～4倍，而不同农作物之间的差别则达到27倍[9]。在植物修复能力的评价体系中包括两个重要指标：生物富集系数(bioconcentration factor，BCF)和转运系数(translocation factor，TLF)。其中，BCF是植物地上部分的重金属富集浓度与土壤介质中重金属浓度的比值，TLF是植物地上部分的重金属浓度和根中重金属浓度之间的比值。BCF和TLF都大于1是判定为超富集植物的重要标准。一些具备超富集能力的植物类型，比如牛皮菜(Betavulgaris)被发现具有累积90Sr的功能[10]。然而，这些植物的生物量相对较小，在长期的修复时间内吸收重金属的总量有限，限制了这些植物的修复效率和效果。在某些情况下，较高的地上生物量可以弥补较低的地上富集浓度[11]。因此，植物的生物量也被列为评价修复能力的重要指标之一。理想的修复植物应该具有3个特征：1)BCF>1；2)TLF>1；3)生物量大。一些能够富集重金属的作物品种被用于植物修复，比如水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和高粱(Sorghumbicolor)的地上部分能够富集锶[12]。反枝苋(Amaranthusretroflexus)地上部分富集90Sr的浓度低于印度芥菜(Brassicajuncea)和宽叶菜豆(Phaseolusacutifolius)，但由于反枝苋的生物量较大，因此，其地上部分富集的90Sr总量高于印度芥菜和宽叶菜豆[13]。高粱是一类能源作物，具有生物量高、生长速度快等特点。此外，高粱的秸秆可通过发酵生产生物燃料乙醇，发酵后的废渣可作为养殖饲料和造纸原料，从而可以循环利用，具有良好的环境和经济效益。已有研究表明高粱具有积累重金属至地上部分的能力，比如镉和锌[14]。Wang等[15]研究发现高粱对金属锶的转运系数接近于1，具有修复锶污染土壤的潜能。

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)是所有菌根种类中最重要的互惠共生体之一，近85%的植物种类能够形成丛枝菌根(AM)，在自然生态系统和农业生态系统中广泛分布。近些年来，应用植物-微生物共生体强化植物的抗污染耐性，提高污染土壤修复效率已经成为相关领域新的研究热点。陈良华等[16]研究表明接种AMF能显著提高美洲黑杨(Populusdeltoides)对铅和镉的富集能力。研究表明在重金属污染条件下，接种AMF能提高宿主植物的养分吸收能力、增加植物地上生物量、增强植物抗氧化酶系的抗逆能力，从而提高植物对重金属的富集能力[17-18]。研究表明AMF能够增加甘草(Glycyrrhizauralensis)生物量、根系磷含量和叶片中的叶绿素含量，并显著提高甘草对重金属的耐受能力[19]。研究表明接种AMF能促进根际土壤磷酸酶和蛋白酶的活性，且酶活性的增加量与菌根侵染率呈极显著相关关系，接种AMF能够改善翅果油树(Elaeagnusmollis)幼苗的微生态环境，提高根际土壤肥力[20]。本研究拟开展AMF对高粱的锶富集和转运能力的影响以及土壤酶活性和土壤养分状况研究，评价接种AMF对高粱根际土壤微生态环境的影响，评估AMF在强化高粱修复核素锶污染土壤的应用价值，从而对AMF-植物共生体对核素锶污染的土壤修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种：丛枝菌根真菌为透光球囊霉(Glomusdiaphanum)、地球囊霉(Glomusgeosporum)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、地表球囊霉(Glomusversiforme)。菌种由甘肃农业大学提供。以花生(Arachishypogaea)为宿主在土壤中进行菌种培育繁殖80 d后，清除花生的地上部分，将土壤和侵染的根段混合物作为接种剂，另以相同重量在烘箱中经170 ℃灭菌2 h的菌剂土壤为对照(non-AFM)。

供试植物：本实验中所用的供试植物为高粱。高粱种子由甘肃农业大学提供。种子经75%的酒精浸泡5 min后用3% H2O2灭菌10 min，再用灭菌水冲冼3次。

供试土壤：实验所用土壤均取自河南科技大学周山校区农场土。土壤基本理化性质按常规方法测定[21]。试验所用土壤的基本理化性质如表1所示。

表1 土壤基本理化性质Table 1 Soil physical and chemical properties

1.2 试验设计

试验于2017年3月1日至5月30日在河南省洛阳市开元校区农场进行。经过混合处理后的实验用土均匀地放入袋子中，并用高压灭菌锅在121 ℃下进行湿热灭菌处理24 h，冷却待用。每个塑料盆(高=16 cm，底径=12 cm，口径=22 cm)装风干土8 kg，将20粒高粱种子播种于每个塑料盆中，待出苗后定苗为10株。将分析纯试剂SrCl2·6H2O溶于水中制成溶液，施入盆中设置Sr2+浓度为725 mg·kg-1，充分混匀，平衡3周。由于土壤中锶的本底值为25.06 mg·kg-1，因此，最终土壤中的锶浓度为750 mg·kg-1。采用双层接种法将接种剂以每盆40 g的量加入盆钵2/3处(撒匀，铺平)，以灭菌后的接种剂作为对照(non-AFM)。每个处理重复3次。

1.3 测定指标与方法

1.3.1菌根侵染率 在锶处理60 d后，取锶浓度处理的高粱整株幼苗，每盆取6株。分别用直尺、游标卡尺，对幼苗的株高、根长进行测量。丛枝菌根染色参考Phillips等[22]的方法进行。计算菌根侵染率。

菌根侵染率=(根段中被菌根侵染的长度/检测根段的长度)×100%

1.3.2菌根依赖性 取不同AMF处理的高粱整株幼苗，每盆取6株。105 ℃杀青30 min，然后在55 ℃条件下持续烘干至恒重，用分析天平称重。计算菌根依赖性。

菌根依赖性=(接种丛枝菌根真菌的植株干重/未接种的植株干重)×100%

1.3.3株高、根长、生物量的测定 取不同AMF处理的高粱整株幼苗，每盆取6株。分别用直尺、游标卡尺，对幼苗的株高、根长进行测量。105 ℃杀青30 min，然后在55 ℃条件下持续烘干至恒重，用分析天平称量其干重。

1.3.4锶富集浓度的测定和计算 植物被烘干后，取其根、茎、叶3种器官各2.0 g，250 ℃灰化处理，持续增温至500 ℃，灰化2 h。将1 g灰化样品加入6 mL的HCl-HNO3-H2O2(体积比为1∶1∶1)。采用ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱法)测定锶的含量[23]。

生物富集系数(BCF)=植物地上部分锶含量/(处理锶浓度+土壤本底值)。

转运系数(TLF)=地上部分锶富集浓度/根中锶富集浓度。在富集植物中，TLF>1， 在非富集植物中，TLF<1[24]。

1.3.5土壤营养成分的测定 采用重铬酸钾外加热法测定土壤有机质，采用凯氏蒸馏法测定土壤全氮，采用浓硫酸高氯酸消解—钼锑抗比色法测定土壤全磷，采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定土壤速效磷，采用乙酸铵浸提—原子吸收光谱法测定土壤速效钾[21]。

1.3.6土壤酶活性的测定 采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定转化酶活性，采用对硝基苯磷酸二钠(PNPP)比色法测定磷酸酶活性，采用茚三酮比色法测定蛋白酶活性，采用尿素-凯氏定氮法测定脲酶活性，采用TTC法测定脱氢酶活性[25]。

1.4 数据处理

以接种处理为固定因素(自变量)，对所有参数(因变量)进行单因素方差分析。以P<0.05概率水平为最小显著性差异(LSD)进行判定。所有统计分析采用SPSS软件(version 13.0；SPSS Institute Chicago，IL，USA)统计。每个处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 锶胁迫下高粱幼苗的菌根侵染率

图1 锶胁迫下高粱幼苗的菌根侵染率Fig.1 The mycorrhizal infection rate of S. bicolor seedlings under strontium stress 不同小写字母表示不同处理之间差异显著 (P<0.05)。下同。Different lowercase letters in the treatments are significantly different at the 0.05 level. The same below.

4组AMF处理的侵染率都大于50%。侵染率最高的为地球囊霉(75%)，显著高于其他菌种(P<0.05)。摩西球囊霉与地表球囊霉的侵染率无显著差异(P>0.05)，分别为60.67%和54.67%。摩西球囊霉和透光球囊霉的侵染率存在显著差异(P<0.05)，而地表球囊霉与透光球囊霉的侵染率无显著差异(P>0.05)。透光球囊霉的侵染率为50.33%(图1)。

2.2 接种丛枝菌根真菌对锶胁迫下高粱幼苗生长的影响

接种AMF的高粱幼苗的生物量显著增加(P<0.05)，其中，地球囊霉和摩西球囊霉处理组中高粱幼苗的地上生物量显著高于地表球囊霉和透光球囊霉组(P<0.05)。地球囊霉和摩西球囊霉处理组中高粱的地上生物量与对照处理相比分别增加了54.72%和49.82%，根生物量分别增加了53.26%和37.92%。地表球囊霉和透光球囊霉组中高粱的地上生物量与对照相比分别增加了28.91%和33.92%，根生物量分别增加了12.32%和19.44%。接种AMF显著增加了高粱幼苗的株高和根长(P<0.05)。其中，地球囊霉和摩西球囊霉处理组中高粱

幼苗的株高和根长显著高于地表球囊霉和透光球囊霉处理(P<0.05)。地球囊霉和摩西球囊霉处理组中高粱的株高与对照相比分别增加了30.73%和23.02%，根长分别增加了39.87%和36.41%。地表球囊霉和透光球囊霉处理组中高粱的株高与对照相比分别增加了13.03%和10.73%，根长分别增加了11.75%和11.96%(表2)。

表2 接种AMF对锶胁迫下高粱幼苗生长的影响Table 2 The effect of AMF inoculation on the growth of S. bicolor seedlings under strontium stress

注：同列不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Means with different lowercase letters in the same column are significantly different at the 0.05 level in different treatments. The same below.

与对照(菌根依赖性为100%)相比，4组接种AMF的高粱幼苗都表现出显著的菌根依赖性(P<0.05)，说明AMF对高粱幼苗生长具有促进作用。其中，地球囊霉和摩西球囊霉处理组的菌根依赖性显著高于地表球囊霉和透光球囊霉处理(P<0.05)。地球囊霉和摩西球囊霉处理与对照相比分别增加了54.44%和47.61%。与对照相比，地表球囊霉和透光球囊霉接种处理分别增加了25.83%和31.23%(图2)。

图2 锶胁迫下高粱幼苗的菌根依赖性Fig.2 The mycorrhizal dependency of S. bicolor seedlings under strontium stress

2.3 接种AMF对高粱幼苗锶富集能力的影响

与对照相比，经过AMF处理的高粱幼苗地上部分和根中的锶浓度显著增加(P<0.05)；其中最显著的是地球囊霉和摩西球囊霉处理，高粱幼苗地上部分的锶浓度与对照相比分别增加了86.05%和72.33%，根中锶浓度分别增加了30.18%和21.83%。其次是地表球囊霉和透光球囊霉处理，高粱幼苗地上部分的锶浓度与对照相比分别增加了58.89%和62.43%，根中锶浓度分别增加了12.88%和15.48%(表3)。

将4组AMF处理组的侵染率与高粱幼苗地上部分的锶浓度进行相关性分析，结果表明，菌根侵染率与高粱幼苗地上部分的锶浓度呈显著正相关(r=0.706，P=0.010)，即随着菌根侵染率的增加，高粱幼苗吸收锶的能力， 以及转运锶至地上部分的能力均随之增强(图3)。对照组中高粱幼苗对锶的转运系数和富集系数都小于1，分别为0.87和0.62(表4)。AMF侵染后高粱幼苗的转运系数和富集系数都显著高于对照(P<0.05)，除摩西球囊霉处理高粱幼苗的富集系数小于1(0.95±0.06)外，其余的转运系数和生物富集系数都大于1。AMF处理显著增强了高粱幼苗对金属锶的富集能力。

表3 锶胁迫下接种AMF高粱幼苗各部位锶富集浓度Table 3 Effect of AMF on strontium absorption of S. bicolor seedlings under strontium stress (mg·kg-1)

图3 菌根侵染率与高粱幼苗地上部分锶富集浓度的相关性Fig.3 The correlation of mycorrhizal infection rate and shoot strontium concentration of S. bicolor seedlings

2.4 接种AMF对土壤营养成分的影响

接种AMF对土壤有机质、全氮、全钾和速效钾均没有显著影响(表5)。在接种地球囊霉、摩西球囊霉和地表球囊霉处理中，土壤全磷和速效磷含量与对照相比显著减少(P<0.05)，全磷分别减少了20.32%、16.33%和15.89%；速效磷分别减少了18.49%、14.91%和12.98%。

2.5 接种AMF对土壤酶活性的影响

接种AMF显著影响了土壤酶活性，AMF对不同土壤酶活性的影响有差异(表6)。蛋白酶、脲酶和脱氢酶在所有处理中均没有显著差异(P>0.05)。其中，接种AMF显著增加了土壤磷酸酶活性(P<0.05)，与对照相比，增加了21.43%～30.36%。地球囊霉、摩西球囊霉和地表球囊霉接种处理显著增加了土壤转化酶活性，分别增加了28.87%、28.87%和25.77%。

表4 接种AMF对高粱幼苗富集锶的转运系数和生物富集系数的影响Table 4 Effect of AMF on the translocation factor and bioconcentration factor of S. bicolor seedlings

表5 接种AMF对土壤营养成分的影响Table 5 Effect of AMF on soil nutrients

表6 接种AMF对土壤酶活性的影响Table 6 Effect of AMF on soil enzyme activities

3 讨论

3.1 AMF对高粱幼苗抗锶能力的影响

在本研究中，4种AMF对高粱幼苗的侵染率都超过了50%，其中，侵染率最高的为地球囊霉(75%)，显著高于其他AMF(P<0.05)，这可能是因为地球囊霉在锶胁迫下有更好的耐受能力。在本研究中，4种接种丛枝菌根真菌的高粱幼苗都表现出显著的菌根依赖性(P<0.05)，说明丛枝菌根共生体对高粱幼苗生长具有一定的促进作用。接种AMF显著提高了高粱幼苗的生物量(P<0.05)。其中，接种地球囊霉和摩西球囊霉对高粱幼苗生长的促进作用效果最好。地球囊霉和摩西球囊霉处理组中高粱幼苗的地上生物量与对照相比分别增加了54.72%和49.82%，根生物量分别增加了53.26%和37.92%。这可能是由于金属锶抑制了植物生长，AMF侵染高粱幼苗后产生了庞大的植物根系—菌丝体网络，植物提供的碳源通过根的皮层细胞到达菌丝，为菌丝生长提供有利条件，这些菌丝又促进了植物对矿质营养的吸收，提高了植物根系获取土壤中营养物质的能力[26]，从而显著提高了高粱幼苗的生物量。接种AMF处理显著增强了高粱幼苗耐受锶的能力。高粱幼苗对地球囊霉和摩西球囊霉的菌根依赖性最强，生物量分别高于对照54.44%和47.61%。前人研究表明摩西球囊霉等丛枝菌根真菌通过增强植物光合效率及产物同化，从而增加宿主植物的生物量和对金属铯的耐性[20]。丛枝菌根缓解了土壤中锶污染对高粱幼苗生长的抑制作用，说明丛枝菌根-植物的联合修复具有良好的修复效果及应用前景。

3.2 AMF对高粱幼苗富集转运锶能力的影响

AMF通过对重金属的活化或钝化、吸收与固持作用直接影响到植物对重金属的吸收累积和在体内的分配。目前关于AMF对植物富集重金属能力的影响尚没有一致的结论。研究发现接种AMF显著增强万寿菊(Tageteserecta)对Cd的吸收能力以及将Cd向地上部分转运的能力[27]。接种AMF提高了翅荚木(Zeniainsignis)的重金属累积量[28]。在本研究中，AMF活化了土壤中的金属锶，增加了高粱幼苗中的锶浓度。与对照相比，接种AMF处理显著增加了高粱幼苗地上部分和根的锶浓度(P<0.05)。经过AMF处理的高粱幼苗，其地上部分的锶浓度高于地下部分，具体表现在TLF都大于1。综上所述，AMF能够促进宿主植物对核素锶的富集和转运。AMF应用于植物吸收的研究结果证实，在接种AMF之后，植物对重金属的吸收量有显著的增加。这可能是由于在重金属污染条件下，这种由AMF和植物形成的共生体可以改善植物对营养元素的吸收，并且有效地提高植物的抗逆性[29]，以及增强植物对重金属污染的抗性，从而使植物所受到的重金属毒害作用得到缓解[30]，通过对这些重金属离子在植物体内的吸收和转运过程进行调节，使得土壤中的重金属被高效地提取出来，从而实现植物修复[31]。然而，也有研究认为，由于AMF的定殖部位在于植物的根系，因此可以促进根系对重金属的吸收和固持作用，从而导致重金属更多地被固定于土壤中。Liu等[23]研究表明，在高浓度Cd处理水平下，接种摩西球囊霉显著提高了玉米根中Cd的富集浓度，降低了玉米地上部分的Cd富集，表明接种AMF显著增强了玉米对重金属Cd的固持作用。同样地，黄晶等[32]研究发现紫花苜蓿(Medicagosativa)在接种AMF后，Cd和Zn在植物根中的富集浓度显著增加，而地上部分的Cd和Zn含量却呈减少趋势，表明AMF降低Cd、Zn是由于根部向地上部分的转运造成的，进一步使得重金属被固定在土壤当中，从而减轻植物可能遭受的重金属毒害。然而，AMF对植物根系吸收和固持重金属的增强效应，可能是由于接种AMF显著增加了植物生物量，伴随产生了植物对重金属吸收的“稀释效应”[33]。在植物富集重金属总量相同的情况下，AMF处理增加了植物的生物量，则植物体内重金属浓度(植物单位生物量富集重金属的含量)降低。

3.3 AMF接种高粱幼苗对锶污染土壤中养分和土壤酶活性的影响

菌根真菌侵染植物，使植物的根围土壤代谢活动发生改变，从而影响植物根围微生物种群数量的变化。菌根真菌的形成也有利于解磷微生物的生长繁殖，增加土壤中有机磷的含量。AMF能够改善植物的营养状况，尤其是磷营养。AMF会促进植物根系分泌有机酸，活化土壤中的有机磷，分泌磷酸酶水解土壤中的有机或无机磷酸盐，从而增强植物对难溶性磷的吸收，降低重金属的浓度[34]。在本研究中，接种地球囊霉和摩西球囊霉显著提高了土壤全磷和速效磷含量，与对照相比，全磷分别减少30.74%和26.41%；速效磷分别减少了18.49%和14.91%。土壤中这部分磷的减少可能是AMF介导而输送至宿主植物体内。研究表明接种AMF的黑麦草(Loliumperenne)地上部分和根系中的磷含量相比于未接菌黑麦草都有显著提高[35]。在本研究中，接种AMF显著增加了土壤磷酸酶活性(P<0.05)，与对照相比，增加了21.43%～30.36%。地球囊霉、摩西球囊霉和地表球囊霉接种处理显著增加了土壤转化酶活性，增加了25.77%～28.87%。付晓峰等[17]研究表明AMF会促进土壤微生物分泌土壤酶，增强酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性。AMF可通过多种机制来协同影响根际环境，提高土壤养分的可利用性，增加植物生物量，并在一定程度上解除重金属对土壤酶的抑制作用，从而减轻重金属对植物的毒害[36-37]。

4 结论

接种AFM显著增加了高粱幼苗的生物量，缓解了土壤中的锶污染对高粱幼苗生长的抑制作用，提高了土壤磷酸酶活性。AMF处理使高粱幼苗对核素锶的富集、转运能力等都显著增强。其中，地球囊霉对增强高粱幼苗对锶耐受能力的效果最好。综上所述，AMF可促进高粱幼苗对锶的富集和耐受能力，说明丛枝菌根—高粱幼苗共生体具有良好的修复效果和应用前景。