YY1基因对J82膀胱尿路上皮癌细胞增殖侵袭能力的影响

刘翔 耿和 吴宗林 施华娟 张涛

上海市普陀区人民医院泌尿外科（上海 200060）

在世界范围内，膀胱尿路上皮癌在泌尿系统恶性肿瘤中发病率最高［1］，它具有复发率高、易向肌层侵润等特点［2］。近年来该病在我国的发病率有进行性增高的趋势［3］，故对该病增殖、侵袭机制的研究能带来明显的科研及社会价值。 转录因子YY1（Yin⁃Yang1）是锌指类核转录调节因子，通过结合不同的辅助因子，参与细胞周期的调控、肿瘤的形成等多种生物学进程［4］。多项研究显示YY1在包括膀胱癌在内的多项恶性肿瘤中均有表达，并揭示YY1可能是导致正常细胞转变为肿瘤细胞，并且促进肿瘤细胞增殖、转移的关键因子［5-6］。故我们设计本研究来观察YY1在不同表达水平下对J82膀胱尿路上皮癌细胞的增殖、侵袭能力的影响，以探索YY1的表达水平与膀胱尿路上皮癌进展的关系。

1 材料与方法

1.1主要材料和试剂本研究起止时间为2017年4月至2018年4月。J82人膀胱尿路上皮癌细胞购自美国Sciencell公司。细胞培养液采用购自美国Hyclone公司。转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。兔抗人多克隆抗体YY1购自美国ProteintechT公司。Transwell小室购自美国Corning公司。酶标仪购自瑞士TECAN Nanoquant公司。靶向YY1序列的shRNA由上海齐合生物技术有限公司合成，依筛选出来的709、827、1186三个靶标位点进行制备。

1.2细胞培养和转染将J82细胞在含10%FBS的MEM培养基中于37℃、5%CO2培养箱中培养，转染前1天将J82细胞接种到（不含抗生素的培养基）6孔板中，每孔2 mL。等到细胞生长到80%～90%融合度时，将细胞分为三组：（1）空白组未进行转染操作。（2）YY1增强表达组在Opti⁃MEM 250 μL中加入脂质体核酸转染试剂10 μL，在室温下孵育5 min，加入Opti⁃MEM 250 μL和搭载YY1的pFLAG⁃CMV4载体4 μg，转染后6 h后换成完全培养液，转染完成48 h后收集蛋白。（3）YY1沉默组转染时采用pLKO.1puro载体搭载的shRNA，转染方法同YY1增强表达组。

1.3Western blotting检测相关蛋白的表达分别将空白组、YY1增强表达组、YY1沉默组的细胞充分裂解后离心取上清液。配制凝胶置于电泳槽中，取各个处理组蛋白提取液，与缓冲液混合后煮沸、离心，加入孔中进行电泳，将PVDF膜浸泡于转移缓冲液中，修胶后制备转膜“三明治”，将转移盒放入电转仪中进行转膜。封闭、洗膜后加入封闭液稀释的YY1一抗和β⁃actin，孵育洗膜后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。膜于化学发光检测试剂中反应后，在暗室中感光、显影、定影。对胶片进行扫描，比较各组灰度值。

1.4MTT实验检测细胞增殖能力J82细胞在10%FBS的MEM培养基中于37℃、5%CO2培养箱中培养，经0.25%胰酶消化，离心后用完全培养基重悬细胞并计数。将空白组、YY1增强表达组、YY1沉默组的转染混合物加到96孔板的孔底，然后每孔接种8 000个J82细胞。置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48和72 h，然后在96孔板的每个孔中加入10 μL MTT，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育3 h后，弃去MTT和完全培养基，再加入100 μL DMSO，孵育后于酶标仪中检测各孔在490 nm处的吸光度，绘制细胞增殖曲线。

1.5Transwell实验检测细胞侵袭能力在24孔板和上室transwell insert中加入无血清培养液MEM，在37℃的培养箱里平衡一个h以增强细胞的粘附作用。将空白组、YY1增强表达组、YY1沉默组的细胞按3×104个接种在insert的上室内，6 h之后将上室培养基更换为无血清培养基，下室为完全培养基。Corning Polycarbonate Membrane Insert置于37℃、5%CO2的培养环境下培养，48 h后擦除未迁移跨膜的细胞，将小室置于干净的24孔板中并加入0.6 mL 100%甲醇，室温下固定10 min。固定完成后，在另外一个干净的小孔中倒入一定量的0.1%的结晶紫进行染色30 min，清洗残余染料，取膜后置于显微镜下拍照计数，计数小室中央10个随机视野内穿透膜的细胞数取平均值。

1.6统计学方法应用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，实验结果以x±s表示，采用独立样本t检验和单因素ANOVA分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1YY1基因增强表达和沉默的效果对各组Western blotting蛋白印迹灰度值进行分析，使用β⁃actin作为内参，结果显示空白组与YY1增强表达组对比时，YY1蛋白表达水平分别为（5.73±0.30）和（8.14± 0.37），增强组的YY1表达明显升高，差异有统计学意义（P=0.001）。见图1。对比709、827、1 186三个靶标位点制备的shRNA沉默YY1的表达效果，以1 186位点合成的shRNA效果最佳，故后续数据分析及实验步骤均选取该位点shRNA转染的J82细胞作为YY1沉默组。空白组和YY1沉默组对比时，YY1蛋白表达水平分别为（14.52±0.71）和（10.08±0.37），沉默组的YY1表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 增强表达后的J82细胞中YY1表达水平的改变Fig.1 Expression level of YY1 in J82 cells after enhanced expression

图2 shRNA转染后的J82细胞中YY1表达水平的改变Fig.2 Expression level of YY1 in J82 cells after shRNA transfection

2.2 MTT实验依酶标仪检测结果显示，培养24 h后，YY1沉默组、空白组、YY1增强表达组在490nm处的吸光度分别为（0.105±0.014）、（0.106±0.009）和（0.142±0.009）。培养48 h后，三组吸光度分别为（0.124±0.009）、（0.153±0.010）和（0.246±0.013）。培养72 h后，三组吸光度分别为（0.163 ± 0.028）、（0.234 ± 0.011）和（0.382 ± 0.018）。YY1增强表达组在各个时间节点的吸光度均高于空白组和YY1沉默组（P＜0.05）。培养24 h后空白组和YY1沉默组的吸光度无明显区别（P＞0.05）。培养48 h和72 h后空白组吸光度明显高于YY1沉默组（P＜0.05）。细胞增殖曲线显示，YY1沉默组的增殖速率明显低于YY1增强表达组。见图3。

图3 各组J82细胞增殖曲线Fig.3 J82 cell proliferation curve of each group

2.3 Transwell实验随机取10个小室中央视野，计数其内穿透膜的细胞数取平均值，显示YY1沉默组、空白组、YY1增强表达组视野内的细胞计数分别为（7.2±3.6）、（54.4±6.7）和（56.6±10.7）。见图4-7。样本之间差异明显（F=67.804，P＜0.05），其中YY1沉默组的细胞计数明显小于空白组和YY1增强表达组（P＜0.05），空白组和YY1增强表达组之间无明显差异（P＞0.05）。

图4 YY1沉默组中J82细胞的侵袭能力（×250）Fig.4 Invasion ability of J82 cells in YY1 silent expression group（× 250）

图5 空白对照组中J82细胞的侵袭能力（×250）Fig.5 Invasion ability of J82 cells in control group（× 250）

图6 YY1增强表达组中J82细胞的侵袭能力（×250）Fig.6 Invasion ability of J82 cells in YY1 enhanced expression group（× 250）

图7 各组透膜细胞计数Fig.7 Number of invasive cells in each group

3 讨论

肿瘤细胞增殖能力与细胞分裂周期密切相关。细胞分裂周期缩短，则在时间一定的条件下能分裂产生更多的细胞。而细胞周期的长短主要由合成前期（G1）决定，缩短合成前期，能有效地缩短细胞的整个分裂周期，从而促进细胞增殖能力的提升［7］。KANG等［8］研究者发现在体外沉默胃腺癌细胞中YY1的表达后，能使胃腺癌细胞停滞于G1期，同时引起胃腺癌细胞凋亡。此研究还提示敲除YY1的胃腺癌细胞的通过抑制Wnt通路从而表现为扩散能力受限制。同样的现象被CHOW KH在乳腺癌中发现［9］。笔者应用ShRNA干扰技术这一高效、特异的基因沉默手段，成功制备了敲低YY1表达的J82细胞模型。通过对YY1增强表达、YY1正常表达和敲低YY1表达的J82细胞进行实验比较各组的增殖能力，发现敲低YY1表达的J82细胞的增殖能力在各个时间节点均明显弱于YY1增强表达的J82细胞，仅在培养24 h后与空白组的J82细胞达到相近水平，而在48 h和72 h后，亦被空白组明显超越。此结果与上述研究者的研究结果相符，提示YY1被沉默后可能延长恶性肿瘤的G1期以减弱其增殖能力。YY1在膀胱尿路上皮癌中发挥作用的具体机制还有待进一步研究，受KANG等［8］作者研究结果的启示，推测该机制与Wnt通路可能存在关联。

肿瘤细胞的侵袭能力受多种因素影响。Tran⁃swell实验反映的是肿瘤细胞降解细胞外基质的能力，该过程是肿瘤细胞通过分泌蛋白降解酶来完成。基质金属蛋白酶家族（MMPs）是此类蛋白降解酶中具有代表性的一类，近年来大量研究显示MMPs在人类多种恶性肿瘤的侵润转移过程中起到了重要的促进的作用［10-11］。我们通过分析Tran⁃swell实验的结果，发现YY1沉默组中J82细胞的侵袭能力明显弱于空白对照组和YY1增强表达组，而对比空白组和YY1增强组中J82细胞的侵袭能力则未发现明显差异。联想到MMPs在肿瘤细胞侵袭过程中的重要作用，笔者试图寻找YY1与MMPs之间相互作用的证据以解释上述结果。NIE等［12］在食管鳞状细胞癌细胞中发现沉默YY1表达后可抑制该肿瘤细胞的扩散和侵润，其过程与MMP2和MMP9的表达受抑制相关。ZHENG等［13］在胃癌细胞中发现沉默YY1后可以明显减弱MMP14的作用，从而抑制胃癌细胞的转移，同时取决于MMP14水平的不同，YY1在胃癌转移的过程中可正向或负向调节MMP14的功能。故笔者推测膀胱尿路上皮的侵袭能力可能受到YY1调节后的MMPs表达的影响，同时MMPs的表达不一定总是随着YY1表达的增强而同时增强，或许存在某种受MMPs水平所决定的反馈机制，导致本实验结果中空白组和YY1增强组J82细胞的侵袭能力无明显差异，这有待在膀胱尿路上皮癌细胞中对不同YY1表达水平下的MMPs作进一步的检测来寻找线索。

前文中提到，笔者发现有关研究提示Wnt通路可能参与了肿瘤细胞的增殖过程，在肿瘤细胞的侵袭过程中，我们同样发现了类似的线索。DU等［14］发现当人类膀胱癌细胞中Wnt通路被激活后，通路中的重要因子β⁃catenin水平升高，刺激MMP9水平也升高从而增强膀胱癌的侵袭能力。结合其他作者在他们的研究中发现YY1可影响MMPs表达水平的结论，推测Wnt通路很可能是YY1作用于MMPs的中间通路，有待进一步研究的证明。

膀胱尿路上皮癌的增殖和侵袭均是十分复杂的过程，我们的研究结果提示沉默YY1基因可减弱J82膀胱尿路上皮癌细胞的增殖和侵袭能力，对其进行进一步研究有利于揭示膀胱尿路上皮癌进展的机制，为针对该肿瘤的治疗提供具有前景的作用靶点。