ERK/c-Fos信号通路调控KOR在瑞芬太尼诱发痛觉过敏中的作用*

陈 岗 李晶晶 宋凤香 马卫兰 马晶晶 武淑晶 邓立琴△

（1宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2宁夏医科大学总医院麻醉科，银川750004）

瑞芬太尼诱发痛觉过敏(remifentanil-induced hyperalgesia, RIH)是指术中使用瑞芬太尼后可引起基础痛阈值降低，痛觉敏感性增加或镇痛药的需求增加。RIH是术中使用瑞芬太尼后面临的十分棘手的问题，给术后疼痛管理带来了极大的挑战。迄今为止，RIH的具体机制尚未阐明。研究报道：RIH的发生与脊髓p38 及ERK MAPKs活化，c-Fos的表达增加有关[1～3]。本课题组前期研究证实：RIH脊髓中枢敏化的发生与抑制脊髓κ阿片受体(kappa-opioid receptors, KOR)功能有关[4]，但其细胞内信号通路尚不清楚。因此本研究拟探讨瑞芬太尼是否通过激活脊髓ERK/c-Fos信号通路，抑制脊髓KOR功能，从而加重大鼠术后痛觉过敏。

方 法

1.主要仪器与药物

微量泵WZ-50C2（浙江大学医学仪器有限公司）。von Frey纤维丝（Stoelting公司）。全自动热刺痛仪PL-200（成都泰盟科技有限公司）。奥林巴斯电子显微镜JEM-2100（Olympus 公司）。聚乙烯导管PE-10/20（上海必鼎它生物科技有限公司）。κ受体激动剂U50488H（Enzo公司提供，每支10 mg）。ERK抑制剂PD98059（Abcam公司，每支1 mg）。瑞芬太尼（浙江人福药业，批号6171001，每支2 mg）。

2.实验动物

健康雄性SD大鼠，体重230～300 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SXK（宁）2017-0001。清洁饲养，自由进食水，温度为22～26 ℃，湿度为40%～60%，自然昼夜节律。大鼠每天适应实验室环境，每天30 min连续3天，第四天鞘内置管前测定右侧后爪机械缩足阈(paw withdrawl threshold, PWT)和热缩足潜伏期(paw withdrawl latency, PWL)的基础值。

3.模型制备

（1）大鼠鞘内置管模型的制备

用10%水合氯醛溶液（用法：0.3～0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧位固定于操作台上，大鼠颈背部剃毛后进行碘伏消毒铺单，沿L3-L4棘突间正中作2 cm纵行切口，充分暴露L3-L4棘突和间隙，将制备的导管由穿刺点向尾端置入1.2～1.5 cm，置管时可见大鼠有甩尾和下肢摆动，并且导管内有清亮脑脊液流出，表明置管位置正确。八字缝合固定导管后，将导管另一端经皮下从项部穿出，导管末端外露约2 cm，用肝素生理盐水10～15 μl预冲导管，保持管内通畅，通过热凝封闭导管末端开口。逐层缝合关闭手术切口。术后单笼饲养。置管后第4天，选择双下肢活动无异常的大鼠，经鞘内导管注入2%利多卡因15 μl，如果大鼠出现双下肢麻痹拖行，夹尾反射消失，证明置管位置正确，大鼠鞘内置管模型制备成功。

（2）大鼠右侧跖底切开术后疼痛模型的制备

选择鞘内置管5天后恢复良好的大鼠，在异氟烷吸入或瑞芬太尼静脉泵注下行右侧跖底切开手术。碘伏消毒，11号无菌刀片从跖底近端0.5 cm处向远端做1 cm的切口，挑起跖底肌肉并纵向分离，注意保持肌肉的起止及附着完整，按压止血后，用5-0丝线缝合伤口。术后30 min，大鼠出现右侧后爪不愿着地及舔咬等现象，说明术后切口痛模型制备成功。

4.分组

选择鞘内置管术后5 d恢复良好的大鼠，即置管后5 d右侧跖底PWT和PWL恢复至置管前水平。采用随机数字法将36 只大鼠分为6组(n=6)：对照组(C组)、U50488H组(U组)、PD98059组(P组)、瑞芬太尼组（R组）、瑞芬太尼 + U50488H组(RU组)、瑞芬太尼组 + PD98059组(RP组)。C组鞘内注射生理盐水10 μl，尾静脉注射生理盐水25 μl/min共30 min，1.5%异氟烷吸入麻醉下行右侧跖底手术；U组鞘内给予U50488H(50 nmol /10 μl) 30 min后，尾静脉注射生理盐水25 μl/min共30 min，1.5%异氟烷吸入麻醉下行右侧跖底切开术；P组鞘内给予PD98059(20 μg/10 μl) 30 min 后，尾静脉注射生理盐水25 μl/min共30 min，1.5%异氟烷吸入麻醉下行右侧跖底切开术；R组鞘内给予生理盐水10 μl后，尾静脉注射瑞芬太尼 10 μg·kg-1·min-1共 30 min，行右侧跖底切开术；RU组鞘内给予U50488H(50 nmol /10 μl) 30 min后，尾静脉注射瑞芬太尼10 μg·kg-1·min-1共 30 min，行右侧跖底切开术；RP组鞘内给予 PD98059(20 μg/10 μl) 30 min 后，尾静脉注射瑞芬太尼 10 μg·kg-1·min-1共 30 min，行右侧跖底切开术。于置管前(B-1)，术前(B-2)，术后1 h，2 h，4 h，1 d，2 d, 3 d(PO 1 h，2 h，4 h，1 d，2 d，3 d)测定每组大鼠右侧后爪PWT和PWL。

5.指标测定

（1）机械缩足阈(paw withdrawal threshold,PWT)的测定

用von Frey纤维丝(0.4，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，15.0 g)采用序贯法测试右侧跖底PWT，从2.0 g的纤维丝开始，按照公式50 % PWT(g) =10lgX+kδ，测算出50%缩足阈值(50% PWT: g)即机械触痛阈：其中X为最后刺激使用克数，k为该刺激方式的系数，δ是指各刺激力度对数值后的平均相邻间距，此处δ =0.224。每只大鼠间隔5 min测1次，测试3次，取平均值为该时间点的机械触痛阈。

（2）热缩足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)的测定

用PL-200热刺痛仪垂直照射右侧跖底，记录热照射右侧后爪缩爪潜伏期(s)。防止大鼠跖底发生热损伤， 仪器自动切断为20 s。每只大鼠间隔5 min测1次，测试3次，取3次平均值为大鼠PWL(s)。

（3）Western blot测定脊髓p-ERK1/2及c-Fos的表达水平

疼痛行为学测定结束后，10%水合氯醛溶液(0.8～1.0 ml/100 g)腹腔注射，深麻醉下迅速取出腰膨大，液氮保存。取出脊髓组织称重，每100 mg组织加入1 ml的细胞裂解液，冰上充分匀浆后，在4℃下12 000 rpm离心10 min，吸取上清液即为组织总蛋白溶液，- 20℃冰箱保存。取20 μl采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定标本蛋白浓度。取等量蛋白标本加入SDS上样缓冲液混合，煮沸3 min使其变性，10% SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜上。转膜结束后，取出PVDF膜，用TBST液洗膜2次，每次5 min；丢弃TBST液，加入5%脱脂奶粉10 ml室温下封闭2 h，TBST液洗膜2次，每次5 min，加入兔抗大鼠ERK、pERK1/2、c-Fos一抗（1:1 000，Santa Cruz公司，美国），4℃孵育过夜，TBST洗涤 3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗（1:2 000，Santa Cruz公司，美国）室温下孵育2 h；在暗室中将PVDF膜置于暗盒中，滴加发光液，使用化学发光成像分析系统 LAS-4000（GE公司，美国）曝光，用Imagequant TL软件（GE公司，美国）对图像进行扫描，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

（4）电镜观察脊髓背角突触可塑性

用10%水合氯醛溶液(0.8～1.0 ml/100 g)腹腔注射，深麻醉下暴露心脏，用4%多聚甲醛心脏灌注至大鼠四肢僵硬为止。快速取出腰膨大脊髓，将脊髓背角切成1mm3的小块，2.5%戊二醛溶液后固定(4℃)、置入0.1 M PBS液漂洗3次，每次10～15 min；1%四氧化锇固定1 h，0.1 M PBS液漂洗3次，每次10 min；酒精逐级脱水、包埋、切片；醋酸铀、硝酸铅双重染色；HITACHI H-7650型透射电镜观察脊髓背角突触超微结构并照相。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对突触数目、突触后致密物(postsynaptic density, PSD)厚度、突触间隙宽度、突触活性区长度、突触曲率等定量分析（每组任意选取30个突触取平均数）。每组大鼠(n=6)的突触数目是每只大鼠观察5个视野的突触数目总和的平均数。突触曲率以突触界面弧长与弦长的比值表示。

6.统计学分析

采用SPSS 20.0统计学分析软件进行分析，疼痛行为学结果符合正态分布，以均数±标准误(±SEM)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析。Western blot结果及突触可塑性指标，以均数±标准差(±SD)表示。组间比较采用单因素的方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

本研究采用术后切口痛模型简单易行，所有大鼠术后立即表现出右侧后爪不愿着地及舔咬等现象，成功率100%。

1.各组大鼠PWT和PWL的变化

各组大鼠鞘内置管前和跖底手术前PWT和PWL无明显变化(P＞ 0.05)；与鞘内置管前(B-1)和跖底手术前(B-2)比较，各组术后1 h～3 d PWT和PWL明显降低(P＜0.05)。与C组比较，U组和P组术后各时间点PWT、PWL无显著性变化(P＞ 0.05)，R组术后各时间点PWT、PWL明显降低(P＜0.05)；与R组相比，RU组和RP组术后各时间点PWT、PWL明显增加(P＜0.05，见表1、表2、图1）。

表1 各组大鼠PWT的比较(g, n=6,±SEM)Table 1 Comparison of paw withdrawal threshold between groups(g, n=6,±SEM)

表1 各组大鼠PWT的比较(g, n=6,±SEM)Table 1 Comparison of paw withdrawal threshold between groups(g, n=6,±SEM)

*P＜0.05 ，与 C 组比较；#P＜0.05， 与 R 组比较； △P＜0.05，与基础值 B-1 和 B-2 比较*P ＜0.05, compared with group C; #P＜0.05, compared with group R; △P＜0.05, compared with B-1 and B-2.

组别Group B-1 B-2 PO 1 h PO 4 h PO 1 d PO 2 d PO 3 d C 14.51±0.45 14.40±0.66 7.51±0.23△ 6.11±0.87△ 5.56±0.87△ 6.72±0.89△ 8.41±0.48△U 14.62±0.52 14.65±0.76 8.30±0.77△ 7.50±0.32△ 6.22±0.63△ 7.93±0.94△ 9.33±0.67△P 14.40±0.78 14.32±0.54 7.07±0.40△ 7.50±1.02△ 6.88±0.75△ 7.51±1.12△ 8.98±0.83△R 14.58±0.83 14.45±0.33 5.62±0.46*△ 5.48±0.62*△ 4.50±0.75*△ 4.62±0.76*△ 7.34±0.33*△RU 14.47±0.77 14.41±0.29 7.00±0.66#△ 6.90±0.62#△ 5.70±0.89 #△ 7.72±0.62 #△ 8.59±0.54 #△RP 14.80±0.20 14.61±0.59 7.12±0.54 # △ 6.78±0.82#△ 5.81±0.77 #△ 8.40±0.82 #△ 8.77±0.65 #△

表2 各组大鼠PWL的比较(s,n=6,±SEM)Table 2 Comparison of paw withdrawal latency between groups(s,n=6,±SEM)

表2 各组大鼠PWL的比较(s,n=6,±SEM)Table 2 Comparison of paw withdrawal latency between groups(s,n=6,±SEM)

*P ＜0.05 ，与 C 组比较；#P＜0.05， 与 R 组比较；△P＜0.05，与基础值 B-1 和 B-2 比较*P ＜0.05, compared with group C; #P＜0.05, compared with group R; △P＜0.05, compared with B-1 and B-2.

组别Group B-1 B-2 PO 1 h PO 4 h PO 1 d PO 2 d PO 3 d C 15.45±0.21 14.36±0.26 8.51±0.32△ 7.71±0.57△ 6.78±0.66△ 6.72±0.59△ 9.41±0.43△U 15.62±0.45 14.44±0.32 8.66±0.47△ 8.50±0.48△ 7.22±0.56△ 7.83±0.84△ 9.53±0.67△P 15.48±0.32 14.29±0.34 8.07±0.40△ 8.50±1.02△ 8.88±0.75△ 7.51±1.05△ 9.78±0.54△R 15.67±0.43 14.15±0.43 6.62±0.46*△ 6.56±0.44*△ 5.61±0.62*△ 5.12±0.98*△ 7.49±0.44*△RU 15.47±0.39 14.21±0.39 9.60±0.72#△ 9.21±0.53#△ 7.70±0.51#△ 7.72±0.91#△ 9.59±0.41#△RP 15.80±0.25 14.28±0.32 9.42±0.65#△ 9.78±0.58#△ 7.81±0.77#△ 7.40±0.82#△ 9.77±0.65#△

2.各组大鼠脊髓背角pERK1/2和c-Fos的表达情况

与C组比较，各组脊髓ERK表达无明显差异(P＞ 0.05)。与C组比较，R组脊髓p-ERK1/2表达明显增加(P＜0.05)，其他各组脊髓p-ERK1/2表达无显著性变化(P＞ 0.05)；与R组相比，RU组和RP组脊髓p-ERK1/2表达明显降低(P＜0.05，见图2)。

与C组比较，R组脊髓c-Fos表达明显增加(P＜0.05)，其他各组脊髓c-Fos表达无显著性变化(P＞ 0.05)，与R组相比，RU组和RP组脊髓c-Fos表达明显降低(P＜0.05，见图3)。

3.各组大鼠脊髓背角突触超微结构的改变

与C组比较，U组和P组脊髓背角突触数目、PSD厚度、突触间隙的宽度、突触活性区长度以及突触曲率无显著性变化(P＞ 0.05)，R组脊髓背角突触数目、PSD厚度、突触活性区长度以及突触曲率明显增加(P＜0.05)，突触间隙的宽度明显变窄(P＜0.05)；与R组相比，RU组和RP脊髓背角突触数目、PSD厚度、突触活性区长度以及突触曲率明显明显减少(P＜0.05)，突触间隙的宽度明显增加(P＜0.05，见表3、图4)。

图1 各组大鼠不同时间点PWT及PWL比较（A, B）Fig.1 Comparion of PWT and PWL at different time points between groups(A, B)*P＜0.05, compared with group C; #P＜0.05, compared with group R; △P＜0.05, compared with B-1 and B-2.

图2 各组大鼠脊髓c-Fos的表达情况（A, B）c-Fos蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值反映c-Fos蛋白的相对表达量*P＜0.05，与C组比较；#P＜0.05，与R组比较Fig.2 The expressions of c-Fos in spinal cord(A, B)c-Fos/GAPDH show its relative protein level.*P＜0.05, compared with group C; #P＜0.05, compared with group R.

图3 各组大鼠脊髓ERK及pERK1/2的表达情况（A, B）ERK及pERK1/2蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值反映ERK及pERK1/2蛋白的相对表达量*P＜0.05，与C组比较；P＜0.05，与R组比较Fig.3 The expressions of ERK and pERK1/2 in spinal cord(A, B)ERK/GAPDH and pERK1/2/GAPDH show their relative protein levels.*P＜0.05, compared with group C; #P＜0.05, compared with group R.

表3 电镜下各组大鼠脊髓背角突触可塑性变化Table 3 The changes of synaptic plasticity in spinal dorsal horn under the electron microscope in six groups

图4 电镜下各组大鼠脊髓背角突触可塑性的比较A：C组；B：U组；C：P组；D：R组；E：RU组；F：RP组 Scale bar =500 nm 箭头所指为突触Fig.4 Comparions of of synaptic plasticity in spinal dorsal horn under the electron microscope in six groups(A: group C; B:group U; C: group P; D: group R; E: group RU; F: group RP).Scale bar =500 nm.The red arrow is the synapse.

讨 论

阿片药物诱发的痛觉过敏(opioid-induced hyperalgesia, OIH)是指阿片类药物在治疗疼痛时，可引起痛觉敏感性增加，或使现有疼痛加重的现象[5]。瑞芬太尼是完全人工合成的阿片受体激动药，因其独特的药理特点：起效快、作用时间短、无蓄积、苏醒快等优点，已被广泛应用于全身麻醉的诱导和维持中，被誉为21世纪的阿片类药物。然而，随着瑞芬太尼的应用，临床研究发现瑞芬太尼较其他阿片药物更易诱发术后痛觉过敏[6,7]。目前为止，RIH发生的具体机制尚未阐明，RIH的发生给术后疼痛管理增加了难度。本研究采用国内外文献中最常用的跖底切开手术，建立术后切口痛模型，该模型很好的模拟术后急性疼痛，简单易行，所有大鼠术后立即表现出术侧后爪不愿着地及舔咬等现象，成功率100%。

本课题组前期研究表明[8]，在大鼠术后疼痛模型中，持续尾静脉泵入瑞芬太尼 10 μg·kg-1·min，共30 min，停药后的1 h～3 d双侧跖底均表现出明显术后痛觉过敏，并发现RIH的发生与抑制脊髓KOR功能有关[2]。已报道，瑞芬太尼诱发痛觉过敏呈剂量依赖性[9]。我们先前的研究也显示，随着剂量的增加，RIH更加显著[10]。这也提示临床应用瑞芬太尼应选择最小镇痛剂量，由于临床复合用药及多模式镇痛的应用，因此临床病人术后RIH发生并未引起显著关注。本研究在以往的研究基础上，继续沿用此给药模式，用瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏模型，进一步研究瑞芬太尼是否通过激活ERK/c-Fos信号通路下调KOR诱发RIH的发生。

本研究结果显示：与对照组相比，鞘内注射注射10 μl KOR 激动剂 U50488H(50 nmol)或 10 μl ERK抑制剂PD98059(20 μg)PWT和PWL、脊髓pERK1/2和c-Fos的表达水平、以及脊髓背角突触可塑性均未发生明显改变，说明本研究U50488H所用剂量既无镇痛作用也无致痛效应。与对照组相比，瑞芬太尼组术后各时间点PWT和PWL明显降低、脊髓p-ERK1/2和c-Fos的表达水平明显增加、脊髓背角突触可塑性明显增加，说明持续泵注瑞芬太尼10 μg·kg-1·min(30 min)能明显诱发大鼠术后痛觉过敏，其发生与活化脊髓神经元ERK/c-Fos信号通路有关。在瑞芬太尼泵注前30 min 鞘内注射KOR激动剂或ERK抑制剂，术后各时间点PWT和PWL明显增加、脊髓p-ERK1/2和c-Fos的表达水平明显降低、脊髓背角突触可塑性明显减小，提示瑞芬太尼诱发痛觉过敏与抑制脊髓KOR功能、激活脊髓ERK信号通路有关。

Schepers等报道用大鼠炎性痛觉过敏模型，在延髓头端腹内核(Rostral ventromedial medulla, RVM)注射κ-阿片受体激动剂可以减轻痛觉过敏[11]。国内学者也证实联合κ受体激动剂可获得更为明显的抗瑞芬太尼痛敏效应[12]。这些研究都支持了本研究疼痛行为学的结果：鞘内注射KOR可减轻RIH的发生。另有研究发现：κ阿片受体激动剂可以分别抑制或促进脊髓疼痛传递过程中的谷氨酸突触电流，大鼠应用阿片药物后，在中缝大核(nucleus raphes magnus, NRM)注射κ-阿片受体激动剂可减弱μ-阿片受体激动剂诱导的镇痛；然而，阿片药物停药后相同剂量的谷氨酸受体拮抗剂和κ-阿片受体激动剂可抑制阿片药物引起的痛觉过敏，这可能是KOR激动剂上调了致痛系统。因此κ-阿片受体激动剂可通过调节中枢神经系统内镇痛系统和致痛系统的平衡，发挥拮抗μ-受体介导镇痛和痛觉过敏状态下的两种作用[13]。本研究在瑞芬太尼泵注前30 min，鞘内注射非镇痛非致痛剂量的KOR激动剂或ERK抑制剂，通过阻断瑞芬太尼对脊髓ERK/c-Fos信号通路的激活，抑制脊髓KOR受体功能，降低脊髓背角突触可塑性改变，从而缓解瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏的发生。

基础研究显示：RIH的发生与激动N-甲基-D-天冬门氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)[14,15]、活化蛋白激酶A、激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB)有关，从而使c-Fos蛋白表达上调，而c-Fos蛋白在中枢神经系统形成痛觉记忆，从而产生痛觉过敏。此外瑞芬太尼可引起脊髓背角兴奋性氨基酸—谷氨酸水平明显增加、NMDA受体兴奋，大量Ca2+内流，激活蛋白激酶C，引起突触后膜产生LTP即脊髓突触可塑性增加[16]。上述研究证据支持了本研究电镜下的观察结果，即瑞芬太尼可明显增加脊髓背角突触数目、PSD厚度、突触活性区长度以及突触曲率，减少突触间隙的宽度；而鞘内注射KOR激动剂或ERK抑制剂，可明显改善瑞芬太尼引起脊髓背角突触可塑性改变。这些结果进一步提示：瑞芬太尼通过激活ERK/c-Fos信号通路，抑制脊髓KOR，引起脊髓中枢敏化，加重大鼠术后痛觉过敏。

本研究的局限性：各组大鼠均接受两次手术（鞘内置管术和跖底切开术）可能会引起较长的术后痛觉过敏。但我们两次术前均测量了基础痛阈值，仅选择两个基础痛阈值无差异的大鼠再进行下一步的手术，以减少手术所造成的大鼠术后痛觉过敏。另外，本研究对照组大鼠是在异氟烷吸入麻醉下行右侧跖底切开手术，有研究显示吸入异氟烷后也可引起痛觉过敏的发生[17]，但在临床实践中并未发现这一现象，也缺乏更多的临床研究和基础实验支持。尽管本研究有上述局限性，但本研究所得到的结果能为RIH发生和维持机制的研究提供了研究平台和基础，同时也为RIH的防治提供重要指导和理论依据。

综上所述，瑞芬太尼诱发大鼠术后痛觉过敏与激活ERK/c-Fos信号通路，抑制脊髓KOR有关。