HPLC法测定蒙药哈敦嘎日迪-13丸中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量△

安 明 薄彧坤 杨 丹 张慧敏 邬国栋*

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.包头医学院2014级药学本科，内蒙古 包头 014060)

哈敦嘎日迪-13丸是根据蒙医药理论基础和临床经验设计的处方，并结合现代制剂工艺制成的制剂,制剂批准文号：M14020127，又名：哈敦海鲁木勒十三味丸。处方由主药五灵脂、石菖蒲、诃子和草乌叶、木香，副药，拳参、黑冰片、香青兰以及白豆蔻、红花、甘松、麦冬和牛胆粉这13味药物组成，具有清肺热、消粘、止痢作用，可用于治疗胃肠痉挛、呕吐、腹泻、赤白痢疾等疾病。方中的木香主治行气止痛、健脾消食，其主要成分为木香烃内酯和去氢木香内酯, 本试验参考中国药典、内蒙古蒙药制剂规范中木香测定方法，建立高效液相色谱法同时测定木香烃内酯和去氢木香内酯，可作为哈敦嘎日迪-13丸的质量控制方法。

1 仪器和试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Ultimate 3000系列)、SartoriusBSAS-CW电子天平、AS2060B超声波清洗器、Thermo制纯水仪、过滤装置、AP系列无油隔膜真空泵。

1.2 试剂 色谱纯试剂(甲醇、乙腈)；分析纯试剂(无水乙醇、三乙胺、磷酸、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷)；水为高纯化水；三氯化铁(天津市盛奥化学试剂有限公司)；薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。

1.3 试药 木香烃内酯对照品(批号111524-201710，含量以99.5%计)去氢木香内酯(批号111525-201711，含量以99.8%计)购自于中国食品药品检定研究院。

哈敦嘎日迪-13丸供试品3批(生产批号：710202、201801、201802)，由包头市蒙医中医医院提供；实验室自制模拟小样一批。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本实验研究采用的色谱柱为SHIMADZU C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为甲醇-水(65：35)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：225nm；进样量10μL。从多批检测数据可见，木香烃内酯和去氢木香内酯的理论塔板数在5000以上即可达到较好的分离效果，考虑到不同颜色的色谱柱具有不同的理论塔板数，故确定理论塔板数按木香烃内酯和去氢木香内酯峰计算应不低于5000[1]。

2.2 对照品溶液的制备 取木香烃内酯对照品0.02266g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成含木香烃内酯0.4509 mg·mL-1的对照品溶液，见图1。同样，取去氢木香内酯对照品0.03813g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成含去氢木香内酯0.3805mg·mL-1的对照品溶液，见图2。

2.3 供试品溶液的制备 取同一批号样品(批号710202)6份，约3.82g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置过夜，称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用25%的甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为样品溶液，用微孔滤膜滤过，即得，见图4。

2.4 模拟样溶液的制备 分别称取哈敦嘎日迪-13所需药材，按照处方比例要求混合，磨成粉末，精密称取约3.82g,置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置过夜，称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为样品溶液，用微孔滤膜滤过，即得，见图5。

2.5 阴性对照溶液的制备分别称取除木香外的其它药材，按照哈敦嘎日迪-13处方比例要求混合，研磨成粉，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液，见图6。

2.6 专属性试验 分别精密量取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、模拟样溶液和阴性对照品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件下，记录色谱图，结果见图6。结果表明，在本色谱条件下供试品溶液以及模拟样溶液中木香烃内酯和去氢木香内酯与药品中的其他成分分离度好，在相同保留时间内都有对应的色谱峰，而在此保留时间内阴性对照品溶液并没有干扰，故可知本次试验方法的专属性良好。

2.7 线性关系考察 取482.2μm/mL木香烃内酯及423.152μg·mL-1对照品溶液5mL加入到20mL容量瓶中，精密加入甲醇制成含107.4μg·mL-1木香烃内酯及105.788μg·mL-1去氢木香内酯的混合对照品溶液；分别精密吸取2μL、4μL、6μL、8μL，10μL、12μL、及6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL注入高效液相色谱仪中[2]。以峰面积对浓度进行回归分析，木香烃内酯的回归方程：y=6.8165x+0.0487,r=0.99998；去氢木香内酯的回归方程：y=5.0662x-0.0805,r=0.99995；结果显示：木香烃内酯在0.2148μg·mL-1～1.20288μg·mL-1的质量浓度范围内相应峰面积呈良好的线性关系，去氢木香内酯在0.634728μg·mL-1～1.692608μg·mL-1，标准曲线结果见图7、图8，数据见表1、表2。

表1 木香烃内酯的标准曲线数据表

浓度C(μg·mL-1)0.21480.42960.64440.85921.07401.20288平均峰面积A6.862213.679320.522127.337534.038640.9882

由表中数据可知：木香烃内酯在0.2148～1.202888μg·mL-1的质量浓度范围内与相应的峰面积呈现良好的线性关系。

表2 去氢木香内酯的标准曲线数据表

由表中数据可知：去氢木香内酯在0.6347～1.6926μg·mL-1的质量浓度范围内与相应的峰面积呈现良好的线性关系。

2.8 精密度试验 取“2.2”项下的木香烃内酯和去氢木香内酯对照品溶液10μL,按照“2.2.1.1”项下的色谱条件连续重复进样6针，木香烃内酯峰面积的平均值为124.4337，RSD为0.12%(n=6)，去氢木香内酯峰面积的平均值为83.0762，RSD为0.41%(n=6)说明其精密度良好。

2.9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0h,2h,4h,8h,12h注入高效液相色谱仪10μL按照“2. 1”项下的色谱条件进行测定，数据见表3、表4。

表3 不同时间测定样品中木香烃内酯的峰面积积分值

表4 不同时间测定样品中去氢木香内酯的峰面积积分值

由表中数据可知，供试品溶液中的木香烃内酯及去氢木香内酯在12h之内稳定，稳定性良好

2.10 重复性试验 取同一批号样品(批号710202)6份，约3.82g，精密称定，按照“2.3供试品溶液的配制”项下的方法平行制备6份供试品溶液，并且按照“2.1”项下的色谱条件测定木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积。计算可得各份样品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，结果表明，哈敦嘎日迪-13丸中木香烃内酯及去氢木香内酯的重复性较好,见表5、表6、图9。

表5 木香烃内酯重复性测定结果

表6 去氢木香内酯重复性测定结果

2.11 加样回收率试验 精密称定样品(批号710202)9份，每份约1.91g，分为3组，分别置于9个具塞锥形瓶中，再分别在3组具塞锥形瓶中精密加入木香烃内酯对照品溶液(浓度0.4509 mg·mL-1)2mL，4mL,6mL。(约相当于供试品含有量的50%，100%，150%)再加入去氢木香内酯(浓度0.3805mg/mL)4mL，8mL，12mL，(约相当于供试品含有量的50%，100%，150%)再加入甲醇44mL，38mL，32mL。分别注入上述溶液各10μL到高效液相色谱仪中。结果见表7、表8。

表7 木香烃内酯加样回收率测定结果

表8 去氢木香内酯加样回收率测定结果

结果表明：本方法具有较好的加样回收率。

2.12 提取效率试验 以甲醇50mL作为提取溶剂进行超声提取，为保证被测成分提取完全，试验中考察了超声提取10min，20min，30min,40min不同超声提取时间对提取效率的影响，结果见表9、表10。

表9 木香烃内酯提取试验

表10 去氢木香内酯提取试验

由表中数据可见，超声处理30min后，供试品中木香烃内酯及去氢木香内酯的含量趋于稳定，故将提取效率时间定为30min。

3 样品含量测定

取3批样品(批号为：71020、802202、802202)每批2份，每份精密称定约3.82g，另取1批模拟样2份，每份精密称定约3.82g，按照“2.3”项下的供试品溶液制备。分别精密量取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按“2. 1”项下的色谱条件测定，以外标法计算样品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，结果见表11、表12。

表11 样品中木香烃内酯含量测定结果

表12 样品中去氢木香内酯含量测定结果

续表12 样品中去氢木香内酯含量测定结果

4 讨论

4.1 检测波长的选择 精密称取木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，于紫外-可见分光光度计上，在190nm～600nm做光谱扫描[3]。结果显示木香烃内酯和去氢木香内酯在225nm处有最大吸收，并参照中国药典 “木香”含量测定项下木香烃内酯和去氢木香内酯的测定方法，最终选择225nm作为检测波长。

4.2 流动相的选择 本次实验使用高效液相色谱法，在实验过程，笔者参照《中国药典》2015年版“木香”药材中木香烃内酯和去氢木香内酯的测定方法，流动相为甲醇-水(65：35)，发现该色谱条件下，分离度好，理论塔板数较高，并具有较适宜的保留时间，故作为检测流动相。

4.3 提取溶剂的选择 为了有效提取木香中木香烃内酯和去氢木香内酯，笔者通过参照中国药典 “木香”项下木香烃内酯和去氢木香内酯含量测定方法，最终选用甲醇作为提取溶剂。并参照内蒙古蒙药制剂规范，加入甲醇50mL提取较完全。

5 结论

哈敦嘎日迪-13丸是以五灵脂、草乌叶、诃子等13味蒙药组成的蒙药制剂。为了更好的控制本品的质量，本研究采用高效液相色谱法，测定哈敦嘎日迪-13丸中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，建立了以木香烃内酯和去氢木香内酯含量为依据的质量标准。并对含量测定指标进行方法学考察，结果表明，此方法简便易行、专属性强、分离度好、测定结果准确可靠、灵敏、重现性好[4]，可用于哈敦嘎日迪-13丸的质量控制。