苗药紫金龙中生物碱含量的酸性染料比色法测定△

杨雅欣 徐仕娟 冯小翠 罗国勇 张敬杰

(1.贵阳中医学院 贵州省苗医药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳 550002)

紫金龙为毛茛科乌头属植物深裂黄草乌(Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang)的根及根茎。收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)。是苗族习用药材，具有祛风除湿，温经止痛的功效，用于治疗风湿性关节炎等病症[1]。据文献报道，该属植物中的化学成分包括生物碱、黄酮、甾体及糖苷类等，其中有效成分及特征成分主要为二萜生物碱类[2-4]。因二萜生物碱类化合物广泛的生物活性，一直是药物学家寻找新药的一个重要来源[5]。

目前，未见紫金龙总生物碱含量测定的文献报道。酸性染料比色法是测定中药总生物碱含量的一种经典方法[6-7]，本文拟通过紫外-可见分光光度计，利用酸性染料比色法测定苗药紫金龙中总生物碱的含量。旨在建立紫金龙提取物中总生物碱含量测定的方法，为其质量评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 紫外可见分光光度计(UV-500，上海元析仪器有限公司)，超声波清洗器(SK8210HP，上海科导超声仪器有限公司)，恒温水浴锅(DRHH，上海双捷实验设备有限公司)，分析天平(AR2140，上海奥豪斯有限公司)。

1.2 试药 乌头碱对照品(302-27-2，贵州迪大科技有限责任公司，纯度≥98%)；无水乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，石油醚(分析纯，天津市凯信化学工业有限公司)，正丁醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司)，氯仿(分析纯，西陇化工股份有限公司)，甲醇，氢氧化钠等均为分析纯；溴甲酚绿(指示剂,天津市科密欧化学试剂有限公司)，实验用水为蒸馏水。

1.3 药材 药材购自贵阳市万东桥中药市场，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为毛茛科乌头属植物深裂黄草乌Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang的根茎。

2 方法与结果

2.1 试液溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取紫金龙药材粉末(过60目筛)2.0g于25mL的圆底烧瓶中，按紫金龙最佳提取方案[8]，加入固液比1:8 的65%乙醇溶液16mL，85℃水浴回流提取2.5h，冷却，过滤，70℃蒸干溶剂，浸膏加入75%乙醇15mL使之溶解，转入分液漏斗中，分别用等体积的石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，取氯仿萃取液所得浸膏用75%乙醇5mL溶解至完全，精密量取0.3mL于5ml容量瓶中，75%乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱对照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL对照品贮备液，逐级稀释，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的乌头碱对照品溶液。

2.1.3 酸料染料的制备[9]0.05mol/L氢氧化钠溶液的配制：精密称取氢氧化钠0.2g于100mL锥形瓶中，加入蒸馏水使之溶解并稀释至刻度，即得。

溴甲酚绿缓冲液的配制：精密称取溴甲酚绿0.1g，加入0.05mol/L氢氧化钠2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL，即得。

2.2 测定条件的选择

2.2.1 酸性染料的显色方法 精密吸取乌头碱对照品或供试品溶液1.2mL置60mL的分液漏斗中，分别加入溴甲酚绿溶液24mL和氯仿12mL，密塞剧烈振摇20min，静置分层10min，取氯仿层进行紫外-可见光检测。

2.2.2 测定波长的选择 以2.1.1，2.1.2的方法分别制备供试品及对照品溶液，并按照2.2.1的显色方法显色，在190～800nm波长范围内进行光谱扫描，考察吸收波长。结果表明，供试品在410～420nm处有最大吸收，乌头碱对照品在410～415nm处有最大吸收峰，综合考虑，最终选择415nm作为实验检测波长。

2.3 酸性染料比色法的方法学考察

2.3.1 标准曲线的制备 精密称取乌头碱对照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL对照品贮备液，逐级稀释，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的乌头碱对照品溶液。分别精密吸取1.2mL置60mL的分液漏斗中，加入溴甲酚绿溶液24mL和氯仿12mL，密塞剧烈振摇20min，静置分层10min，取氯仿层于415nm波长处测定吸光度值。以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线，得回归方程为Y=2.76X+0.0386(r=0.999，n=5)。结果表明，乌头碱的浓度在0.1mg/mL-0.3mg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 精密吸取浓度为0.2mg/mL的乌头碱对照品置于分液漏斗中，按“2.2.1”项下的操作方法，取氯仿层于415nm波长处测定吸光度，连续测定6次，测得RSD = 0.74%，说明仪器所测得数据准确可靠。

2.3.3 重现性试验 取同一批紫金龙药材细粉6份，每份2.0g，按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液6份，每份1.2mL，依“2.2.1”项下方法处理显色后，于415nm波长处测定吸光度，结果紫金龙中总生物碱平均含量为7.82mg/g，RSD = 1.43%，表明实验方法重现性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液1.2mL，依“2.2.1”项下方法处理显色后，分别在0,20,40,60，80,100min于415nm波长处测定吸光度，结果RSD = 0.80%，表明供试品溶液在100min内基本稳定。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的紫金龙药材粉末6份，分别加入等量乌头碱对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，依“2.2.1”项下方法处理显色后，于415nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算回收率。结果见表1。

表1 紫金龙总生物碱加样回收率测定结果

2.3 样品的含量测定 取4个批次的紫金龙提取物，每个批次平行测定3次，每次精密量取1.2mL，依“2.2.1”项下进行酸性染料比色，取氯仿层于415nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算紫金龙总生物碱的含量，得出紫金龙中总生物碱平均含量为7.27mg/g。

表2 紫金龙提取物中总生物碱含量测定结果(n=3)

3 讨论

酸性染料比色法是生物碱类化合物与氢离子生产阳离子，酸性染料比色与其定量结合成有色络合物，被有机溶剂提取，在一定波长处测定其吸光度，即可计算总生物碱的含量[6]。酸性染料比色法所测定的结果较准确，应用较多。

本实验采用酸性染料比色法，通过紫外-可见分光光度计检测对苗药紫金龙药材总生物碱进行定量分析，建立其中总生物碱含量测定的方案。测得紫金龙提取物中总生物碱的含量平均为7.27 mg/g。该方法具有一定的专属性和准确度，灵敏度高，简便易行，适宜紫金龙药材中总生物碱含量测定。