纤维素原料在不同预处理体系中的多维表征

张乐平 尤宜娇 徐静静 马路 王巍 彭何欢

摘  要：为了研究不同纤维素原料在液氨预处理（LAT）和过氧化氢液氨联合预处理（HP-LAT）下的酶解率及酶解率差异的原因。以芒、杨木、玉米秸秆和竹子四种植物为纤维素原料，分别进行LAT预处理（预处理温度：130℃，驻留时间：10min，固液比：4：3，氨用量比：2.0）及HP-LAT预处理（预处理温度：130℃，驻留时间：10min，固液比：4：3，氨用量比：2.0，过氧化氢用量比：5：3），酶解预处理产物，测其酶解率，并对各类产物进行红外光谱分析。通过实验发现，芒在经过HP-LAT预处理后，酶解率最高（葡聚糖酶解率：85.15%，木聚糖酶解率：85.73%）。由红外光谱图以及超景深显微分析可知在这3种预处理条件中，HP-LAT预处理对木质纤维素内部键、基团的破坏程度最好，最有利于酶解;在这4种木质素原料中，在相同实验条件下，芒内部的键、基团破坏情况最有利于酶解。

关键词：木质纤维素;预处理;过氧化氢;酶解;红外色谱分析

中图分类号：KT6;S216                                 文献标识码：A                                              DOI：10.11974/nyyjs.20180932003

木質纤维素原料是地球上一种储存量极大的生物质能源，也是目前利用率极低的一种可再生能源，其也是各国新资源战略的重点之一[1，2]。木质纤维素原料通过预处理、酶解、发酵，可生成乙醇。我国目前虽然是世界上第3大乙醇生产国，但木质纤维素制乙醇产业还不是很完备。预处理具有提高产率的作用，目前预处理工艺主要分为4种，主要有化学法、物理法、物理化学法及生物法[3-5]。田庆文[6]研究发现氨联合磨盘预处理玉米秸秆的聚糖转化率达到66%，具有很好的预处理效果。根据蔡彦[7]的研究，氨具有较强的消除木质素的能力，可用于木质纤维素的预处理工艺。何士成[8]的研究表明，氨爆可提高麦秆的酶解效率，纤维素转化率达80.53%。赵超[9]采用液氨过氧化氢联合预处理，发现此预处理可有效除去纤维素中的木质素。

1     材料与实验方法

1.1     材料的特点及采集方法

本研究实验室位于浙江省临安市（30o23N，119o52E）浙江农林大学，实验原材料都是选用本地生长的芒、杨木、竹子和玉米秸秆。芒与玉米秸秆于2016年12月进行采收，生长时长约为1a;竹子与杨木采于2016年12月进行采收，生长时长约为3a。收割原材料后，将原材料切割为2cm左右的长条状，然后将其烘干至含水率小于15%，接着用粉碎机将其粉碎，过100目筛，然后密封置于-20℃冷藏柜内冷藏。

1.2     试验设备及试剂

试验中需要用到的一些仪器及分析设备有：真空过滤泵（AP-01D型，天津Auto Science仪器有限公司）、水分测定仪（MA35型，Sartorius AG Germany）、永磁旋转搅拌反应釜（GCF-1L20/350型，大连自控设备厂）、电子天平（AL240型，Mettler-Toledo仪器上海有限公司）、离心机（5425YH023096型，Eppendorf AG Hamburg Germany）、电热恒温鼓风干燥箱（101-2A型，上海东新建材实验设备有限公司）、振荡培养箱（ZHY-111型，上海智诚分析仪器制造有限公司）、干式恒温器（GL-150B型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）、高效液相色谱仪（1200 Series型，Agilent Technologies）、色谱柱（HPX-87H型，Bio-Rad公司）。

试验中需要用到的主要化学试剂有：99%液氨（浙江杭州龙山化工有限公司）、98%硫酸（浙江杭州明星化工有限公司）、30%过氧化氢溶液（江苏彤晟化学试剂有限公司）、柠檬酸（Sigma-aldrich（上海）贸易有限公司）以上四种试剂皆为分析纯;还有标准品：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖（Sigma-aldrich（上海）贸易有限公司）;以及纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶（诺维信（中国）生物技术有限公司）。

1.3     实验方法

实验原材料通过LAT预处理或HP-LAT预处理，将预处理后的材料进行酶解，分别在24h、72h、144h时对酶解液取样，利用高性能液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测各样品中各类单糖的含量，并计算葡聚糖与木聚糖的转化率。参考彭合欢[10]的研究，本实验采用的工艺参数为：过氧化氢用量比：5：3，氨用量：2.0，预处理温度：130℃，反应时间：10min，固液比：4：3。下面依次介绍各个工艺步骤。

1.3.1     LAT预处理

在20g干基原料中加去离子水使其达到4：3的固液比，并将其搅拌均匀，然后放入反应釜并密封。随后将40g液氨注入反应釜中，开始加热至反应釜温度达到130℃，然后保温10min。打开反应釜的开口将氨气缓慢放出，随后将处理后的材料取出，放入通风使原料中的氨充分溢出。再将原料烘干，测其重量及含水率，并计算此反应的损失率[11，12]。

（1）

式中：S—损失率;

g—反应后材料的重量;

c—反应后材料含的水率。

1.3.2     HP-LAT预处理

HP-LAT工艺流程的具体步骤：先根据5：3过氧化氢用量比根据在20g干基原料中加入过氧化氢，搅拌均匀，随后根据LAT预处理的实验方法进行实验。

1.3.3     酶水解

将酶解溶液的量设定为15mL，精确称取0.15g当量葡萄糖的预处理材料，放入酶解瓶中，并加入相应量的蒸馏水，再依次加入0.75mL柠檬酸钠缓冲液及0.045mL抗生素，在50℃恒温箱中保存1h。然后往瓶中依次添加0.038mL纤维素酶，0.048mLβ-葡萄糖苷酶和0.015mL木聚糖酶。放入振荡培养箱内，设置温度为50℃，转速为150r/min[13-14]。

1.3.4     取样

在酶解反应时长为24h、72h和144h时各取1次样。取1mL酶解样品放入离心管中，先将离心管在干式恒温器中加热至99℃保持20min，然后将此离心管冷却5min，使酶解液中的酶失去活性。继而把离心管放入离心机中转速15000rpm離心5min。然后将酶解液过滤，加入到HPLC样品瓶中。

1.3.5     HPLC分析

使用高效液相色谱仪对样品进行HPLC分析。流动相：稀硫酸（0.005mol/L）;流速：0.5ml/min;柱温：50℃;进样量：15μL;样品测试时间：15min。

1.3.6     酸解

通过对4种原料材料的酸解处理可求出各原料中葡聚糖和木聚糖的含量。处理过程如下：取干质为0.3g的木质纤维素原料，随后加入3mL的浓硫酸;将其放在30℃的水浴中2h，随后加入去离子水84mL。然后将样品放入121℃的灭菌锅中停留1h，将样品取样后进行HPLC分析得出各样品中各类单糖的峰面积。根据如下公式可计算出原材料中葡聚糖与木聚糖的百分含量[10]。

葡聚糖的含量计算公式为：

（2）

式中      Cg—葡聚糖的质量浓度

Vg—葡聚糖的质量分数

木聚糖的含量计算公式为：

（3）

式中      Cx—木聚糖的质量浓度

Vx—木聚糖的质量分数

1.4     数据处理

通过HPLC分析可得出各溶液的色谱图，葡萄糖的出峰时间约为10.649，木聚糖的出峰时间约为11.368，阿拉伯糖的出峰时间约为12.491，取各糖的峰值数据，先计算单糖含量[11]。

E=A/L

式中   E—单糖含量;

A—峰面积;

L—由标准品经线性化后得出的斜率。

再按照下列公式计算各类聚糖的酶解率。

葡聚糖酶解率公式：

（4）

式中：dg—葡聚糖酶解率;

Eg—葡聚糖糖含量;

Vg—葡聚糖的质量分数。

木聚糖酶解率公式：

（5）

式中：dx—木聚糖酶解率;

Ex—木聚糖糖含量;

Vx—木聚糖的质量分数。

1.5     超景深显微分析

将未经预处理，经过LAT预处理，经过HP-LAT预处理的材料粘贴在载玻片上，用超景深显微系统进行观测（50～5000倍），对比个材料预处理前后的微观表面。

1.6     红外光谱分析

取分别经过无预处理、LAT预处理与HP-LAT预处理的4种材料少许，加入KBr混合后碾压，制成压片，利用Shimadzu IR Prestige-21进行测试，实验条件为：光谱范围0～4500cm-1，分辨率4cm-1。

2     实验结果与分析

2.1     组分分析

根据酸解结果可测出原材料中各成分的含量，如表1所示。

2.2     不进行预处理条件下糖的转化率

没有预处理时4种原材料各类糖的转化率如图2所示。芒、杨木、玉米秸秆、竹子在酶解144h的葡聚糖酶解率依次为：28.65%、28.49%、28.79%、26.99%;木聚糖酶解率依次为：30.99%、27.81%、28.00%、26.34%。可知不进行预处理的4种木质纤维素原料直接酶解，各类聚糖酶解率都较低，而且不同种类的木质纤维素原料的聚糖酶解率相差不大[15]。

2.3     在LAT预处理条件下糖的转化率

在LAT预处理条件下4种原材料各类糖的转化率如图3所示。在酶解144h之后芒、杨木、玉米秸秆、竹子的葡聚糖酶解率依次为：64.84%、55.14%、62.86%、48.83%;木聚糖酶解率依次为：69.59%、65.98%、66.96%、60.36%。可发现LAT预处理后的木质纤维素原料聚糖酶解率比没有经过预处理材料的聚糖酶解率有明显的提高[16-17]。

2.4     在HP-LAT预处理条件下糖的转化率

在HP-LAT预处理条件下，4种材料各类糖的转化率如图3所示。酶解144h后，芒、杨木、玉米秸秆、竹子的葡聚糖酶解率依次为：85.15%、64.59%、82.65%、57.70%;木聚糖酶解率依次为：85.73%、69.07%、82.71%、62.78%。将其与LAT预处理的聚糖酶解率相比较，HP-LAT预处理后的聚糖酶解率比LAT預处理的聚糖酶解率又有10%左右的提高[18-19]。

2.5     预处理对物理结构的影响

通过对各预处理产物的显微图像分析后表明：未经过预处理的原料表面光滑，细胞排列整齐;经过LAT预处理的原料表面变得粗糙，蜡质层略有翘起;经过HP-LAT预处理的原料纤维结构和细胞壁受到了极大的破坏，酶解的可及性大大提高。

2.6     预处理对化学结构的影响

4种材料分别经过LAT预处理、HP-LAT预处理以及无预处理的红外光谱图如图5所示，对其中的一些特征谱峰进行分析[20，22]。

波数为1050cm-1的谱峰是纤维素、半纤维素一级和二级醇的振动特征峰。通过3条曲线的对比可发现：HP-LAT预处理后的吸光度最低，且吸收区域增大。波数为1250cm-1的谱峰是半纤维素C-O伸缩振动。由图可见，经过HP-LAT预处理后此峰基本消失。波数为1515cm-1和1650cm-1的谱峰为木质素振动吸收特征峰。仔细观察发现在1515cm-1处附近的许多小型波峰经过预处理后基本消失;在1650cm-1处的波峰经过预处理后吸收峰强度减弱，并有分峰现象出现。波数为2920cm-1的谱峰是木质素侧链中甲基、亚甲基和次甲基的C-H伸缩振动。经对比可发现，经过预处理后峰值明显下降。波数为3420cm-1的谱峰是木质纤维素内羟基O-H伸缩振动。通过对比发现，预处理后的峰值降低，吸收峰强度加强，吸收峰区域增大。

通过红外光谱分析可知，预处理可以打断纤维素中的脂键与氢键，使甲基、亚甲基和次甲基基团断裂，并破坏木质素内部分子结构，从而使酶解效率提高，而且HP-LAT预处理的破坏效果比LAT预处理的效果好。

4种材料在上述各波数时都有相同的谱峰特征，说明4种木质纤维素材料的链接键、基团的种类都大致相同，但是各类材料谱峰的值和特征又有细微差异，这说明这4种木质纤维素材料内部的链接键、基团的数量、内部结构不完全相同，这也是各类材料酶解效率有差异的原因。

3     结论

根据4种木质纤维素原料的产糖率分析可知：在不进行预处理的条件下，产糖率最低;在LAT预处理条件下，产糖率有明显提升，其与不进行预处理相比产糖率提高了100%～120%;在HP-LAT预处理条件下，产糖率最高，其与LAT预处理条件相比产糖率又提高了10%～30%。

通过红外色谱分析以及超景深显微分析可知，得出此实验结果的原因在于：HP-LAT预处理与其他2种条件相比，可以破坏更多材料内部的脂键、氢键、甲基、亚甲基、次甲基基团以及木质素，并且可以破坏大量纤维素与细胞壁，为酶的作用创造了更有利的条件。

在不进行预处理条件下，4种原料的糖转化率没有较大差别;而在有预处理条件下，芒的糖转化率最高，依次是玉米秸秆、杨木、竹子。这是因为芒在经过预处理后，内部的键、基团以及木质素的破坏程度最有利于酶解。

参考文献

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