miR-369-5p对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

代 晨，陶 辉，石开虎，徐盛松

(安徽医科大学1.第二附属医院心胸外科；2.心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纤维化是各种因素作用于心脏，引起持续性心肌损伤的病理改变过程，是心肌重构的重要特征，也是许多常见心血管疾病的病理基础，其主要表现为心肌细胞外基质中胶原纤维过量积聚及胶原成分的改变[1]。心肌纤维化在心房颤动的发生、发展中起重要作用，是心房颤动的重要结构基础，严重威胁着人类的健康[2]。目前，心肌纤维化形成的具体机制尚未明确，但已明确心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)的活化增殖是心肌纤维化形成的重要环节。心肌间质主要由CFs构成，其表型可转换为肌成纤维细胞，进一步活化、增殖，并合成、分泌胶原纤维蛋白[3]。另有研究表明，微小核糖核酸(microRNAs，miRs)参与心血管系统疾病的生理及病理过程，miRs是一类内源性、短链、非编码的单链RNA[4]。文献报道，miRs可参与调控心肌纤维化的发生、发展[5]，miR-369-5p作为miRs中的成员，可以诱导DNA组蛋白修饰的表观遗传重编程和去甲基化[6]，而甲基化又与心肌纤维化之间存在着密切的关联[7]。国内外学者对心肌纤维化和miRs进行了大量研究[8]，但miR-369-5p与心肌纤维化之间的作用关系研究尚未见报道。本研究以miR-369-5p为切入点，通过观察其对CFs活化增殖的影响，探讨miR-369-5p的可能作用机制，为心肌纤维化的预防和治疗找到可能的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 40只♂ Sprague-Dawley(SD)乳鼠，清洁级，体质量10 g左右，鼠龄3 d左右，购于安徽医科大学动物实验中心，动物许可证号：scxk(皖) 2017-001。

1.1.2试剂 DMEM培养基、DMSO、CCK-8相关试剂(美国Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)；microRNA-369-5p模拟物、microRNA-369-5p抑制物转染试剂盒、Ez Omics One-Step qPCR试剂盒、U6 snRNA qRT-PCR试剂盒、Hairpin-it miRNA qRT-PCR试剂盒(吉玛公司)；逆转录试剂盒、SYBR PremixExTapⅡ(2×) (TaKaRa公司)；TRIzol试剂、LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合；Ⅰ型胶原前胶原A1(type I collagen procollagen A1，Col1A1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、β-actin的一抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.3仪器 HR30-ⅡA2型生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Step One PCR扩增仪(美国ABI公司)；分光光度仪(德国Implen Gmb H公司)；TU-100恒温金属浴(上海一恒科技有限公司)；MK3酶标仪(荷兰雷勃公司)；倒置相差显微镜(德国Leica公司)。

1.2方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取与培养 SD乳鼠用乙醇浸泡消毒30 s后处死，转移至超净台,取出心脏，用PBS缓冲液冲洗数遍，洗净血块。将洗过后的心脏转移至5 mL灭菌EP管中，用剪刀充分剪碎，加入3 mL的混合酶液(胰蛋白酶 ∶Ⅰ型胶原酶比例为2 ∶1)水浴锅中消化，随后静置1 min，缓慢抽取上清液加入新灭菌离心管，再向其中加入等量的含血清DMEM培养基中和酶的消化，900 r·min-1离心8 min，重复操作3次，使组织块消化充分，得到混合细胞，向各离心管中加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，轻轻吹打数次，转移到培养瓶中，在培养箱中放置1.5 h后，换液贴壁的细胞即为CFs。显微镜下观察通过细胞形态学鉴定CFs，随后将细胞放入细胞培养箱中，继续培养传代，至3～4代可用于实验，显微镜下观察到应用纤维黏连蛋白免疫组化染色阳性者即为CFs。

1.2.2实验分组 实验组：CFs瞬时转染miR-369-5p模拟物及抑制物；空白对照组：CFs不作转染处理；阴性对照组：CFs瞬时转染空载体质粒，不会对基因表达产生任何影响。

1.2.3细胞转染 CFs培养至对数生长期时可以进行转染实验，将CFs消化后计数，等量接种至6孔板上，次日贴壁后进行转染操作。实验组miR-369-5p模拟物上游引物：5’-AGAUCGACCGUGUAUAUUCGC-3’,下游引物：5’-GAAUAUAACACGGUCGAUCUUU-3’； miR-369-5p抑制物的引物序列：5’-GCGAAUAUAACACGGUCGAUCU-3’；阴性对照组的引物序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。按照LipofectamineTM2000 Reagent 和miR-369-5p试剂盒的说明书对各分组的CFs进行细胞转染实验，培养4～6 h，再更换常规培养基培养，分别于24、48 h进行细胞总RNA的提取。

1.2.4提取总RNA及逆转录 提取细胞总RNA，分光光度仪测定RNA的浓度和纯度，选择适宜的RNA样本逆转录为cDNA。按照miRNAs试剂盒说明书操作加样，进行逆转录反应和实时荧光定量PCR，检测miR-369-5p的表达。逆转录反应条件为：25℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，最后4℃保存。取cDNA进行microRNA实时荧光定量PCR反应：预变性95℃ 3 min，PCR反应95℃ 12 s，62℃ 40 s，共进行40个循环的扩增。最后用U6作为内参，根据2-ΔΔCT法计算各组mRNA的相对表达水平。

1.2.5qPCR检测各转染组Col1A1、α-SMA的表达 根据逆转录试剂盒说明书，将各转染组总RNA逆转录成cDNA，用 ABI Step One Real-Time PCR系统进行反应扩增。设置反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s作为熔解曲线阶段。β-actin设定为内参，应用2-ΔΔCT法计算mRNA 的相对表达量。引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6Western blot法检测CFs中Col1A1、α-SMA蛋白的表达 转染后的细胞继续培养48 h，向各细胞培养瓶分别加入1 mL RIPA解液和10 μL PMSF，吹打均匀裂解细胞，提取总蛋白，测蛋白浓度后，-80℃冰箱保存备用。SDS-PAGE蛋白电泳，转膜，TBST洗膜2次，封闭1 h，再次洗膜4次，分别孵育α-SMA、β-actin、Col1A1的一抗，4℃摇床孵育过夜，洗膜后，二抗室温孵育1 h，洗膜4次，采用ECL法显影。结果采用Quantity One V 4.6软件分析，根据测定出目的条带吸光度值，计算 Col1A1、α-SMA的蛋白表达水平。

1.2.7CCK-8试剂盒检测转染后CFs的增殖情况 设计分组：miR-369-5p模拟物组、miR-369-5p抑制物组、阴性对照组、空白组，每组设4个复孔。各转染组的CFs处于对数生长期时用胰蛋白酶消化，加入DMEM中和消化，细胞计数。以细胞密度为5×106·L-1铺于96孔板中，每孔200 μL，置于37℃、5% CO2培养箱培养，连续培养2 d。每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育2 h后测定OD值，实验重复3次。

2 结果

2.1瞬时转染miR-369-5p模拟物、抑制物对miR-369-5p表达的影响如Fig 1所示，CFs瞬时转染miR-369-5p模拟物、抑制物、阴性对照组及空白组后培养48 h，模拟物组相较于空白对照组及阴性对照组miR-369-5p的表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。瞬时转染miR-369-5p抑制物的CFs中miR-369-5p表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig 1 qPCR analysis of miR-369-5p expression after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs for 48

*P<0.05,**P<0.01vsNC and vehicle

2.2转染miR-369-5p模拟物、抑制物对CFs细胞增殖的影响Fig 2结果显示，瞬时转染miR-369-5p模拟物的CFs培养48 h后，实验组细胞活力明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；瞬时转染miR-369-5p抑制物的CFs培养48 h后，细胞活力明显高于空白对照组和阴性对照组 (P<0.05)。

Fig 2 Changes of MFs viability after 48 h of transient transfectionof miR-369-5p mimics and miR-369-5p

*P<0.05vsNC and vehicle

2.3瞬时转染miR-369-5p模拟物、抑制物对Col1A1、α-SMAmRNA表达的影响如Fig 3所示，CFs 瞬时转染miR-369-5p模拟物培养48 h后，Col1A1、α-SMA mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；瞬时转染 miR-369-5p抑制物 48 h后，实验组Col1A1、α-SMA mRNA表达明显高于空白对照组和阴性对照组 (P<0.05)。

Fig 3 Changes of Col1A1 and α-SMA mRNA after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs by

*P<0.05vsNC and vehicle

2.4转染miR-369-5p模拟物、抑制物对CFs中α-SMA、Col1A1蛋白表达的影响如Fig 4所示，瞬时转染miR-369-5p模拟物48 h后的CFs，Col1A1和α-SMA蛋白的表达量相较于空白对照组和阴性对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；瞬时转染miR-369-5p抑制物48 h后的CFs，α-SMA、Col1A1蛋白表达相较于空白对照组和阴性对照组明显升高(P<0.05)。

Fig 4 Changes of protein expression of Col1A1 and α-SMAin cardiac fibroblasts by Western

*P<0.05vsNC and vehicle

3 讨论

在房颤心肌纤维化的发生过程中，CFs的部分表型改变及增殖活化对其有重要影响，心肌组织中有大量的CFs，而心肌细胞外基质主要由CFs合成、分泌[9]。当心肌由于各种致病因素受到损害时，CFs将会活化增殖，并转化为肌成纤维母细胞，且能够合成分泌大量的细胞外基质，如Col1A1、α-SMA等。因此，心肌纤维化的发生主要通过CFs的活化增殖并过度表达Col1A1和α-SMA等细胞外基质，从而使胶原的含量明显增高，胶原纤维广泛沉积于细胞外间质，最终导致纤维化形成[10]。

miR是一种非编码的内源性单链小RNA，其由18～25个核苷酸构成,可以与靶基因mRNA 3′非翻译区形成不完全的互补结合，进一步抑制mRNA转录后的翻译，或者促进特定mRNA降解，来调控基因的表达,从而对细胞的增殖、分化、凋亡等产生影响[11]。研究表明，miR可参与调控CFs活化增殖，与心肌纤维化密切相关，然而，miR-369-5p在CFs中的活化增殖机制尚不十分清楚。本课题通过在CFs中瞬时转染miR-369-5p模拟物和抑制物，通过与正常对照组和阴性对照组相比较，在瞬时转染miR-369-5p模拟物的CFs中，miR-369-5p的表达明显上升；而在转染了miR-369-5p抑制物的CFs中，miR-369-5p的表达明显下降。在瞬时转染miR-369-5p模拟物组中α-SMA和Col1A1的表达下降，而在转染了miR-369-5p抑制物组中α-SMA和Col1A1的表达水平升高。在CFs中瞬时转染miR-369-5p模拟物 48 h后，与空白对照组及阴性对照组相比，CFs活力明显下降；而在CFs中瞬时转染miR-369-5p抑制物 48 h后，同空白对照组及阴性对照组相比，CFs的活力明显增强。

综上所述，在CFs中转染miR-369-5p模拟物后，miR-369-5p的表达量明显增加，而CFs的活化增殖又可被miR-369-5p的高表达所抑制，进而限制心肌纤维化的发生、发展，表明miR-369-5p是CFs 活化增殖潜在的靶分子之一。以上研究表明，miR-369-5p可能通过靶向调控下游基因的表达，进一步促进心肌纤维化，这也为探究miR-369-5p的具体作用机制提供了基础，同时也为干预和预防心肌纤维化提供了新思路。

(致谢：本实验在安徽医科大学第二附属医院中心实验室完成，感谢丁季飞、钱鹏、秦润禾、汪裕琪提供的指导和帮助！)