乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4促进肝癌细胞系迁移和侵袭

邓秀娟，韩 铭，刘顺爱，成 军*，梁跃东*

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004；2.首都医科大学附属北京地坛医院 传染病研究所， 北京 100015)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤，以亚洲和非洲高发[1- 2]。中国也是世界上HCC高发地区，位于常见肿瘤第3位，每年发病人数约30万人。手术切除仍是治疗早期肝癌的最佳选择，许多临床研究表明，肝癌根治性切除后病死率可下降至5%以下，但60%～70%的患者术后5年内会发生转移复发[3]。癌细胞的远处转移是癌致死的首要原因[4]，明确转移复发的生物指标，提供靶向治疗是目前的迫切任务。随着研究的深入，关于肿瘤复发转移的机制研究有了很大的进展，提出了多种多样的新概念[5- 6]。本课题组于2004年筛选克隆了乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4(HBX protein trans-activate gene， XTP4)[7]。近年来研究表明XTP4与乳腺癌、前列腺癌和肝癌等多种肿瘤密切相关[8- 9]，并在肿瘤分级分期和化疗耐药、过度增殖和转移侵袭等中发挥作用[10]。本课题组前期研究发现，XTP4可通过调控Bcl- 2/Bax表达，抑制HepG2细胞的凋亡，参与HBV致病过程[10]。本研究旨在探讨XTP4对肝癌细胞迁移侵袭的影响，明确XTP4是否参与肝癌转移过程，是否有望成为肝癌的靶向治疗新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、质粒和siRNA：人来源肝癌细胞系HepG2、过表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4真核质粒以及对照pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒均由本实验室(首都医科大学附属地坛医院传染病研究所)保存；siXTP4、与目的序列无同源性的通用阴性对照组siNC(上海制药技术有限吉玛公司合成)；课题组前期已经筛选出干扰效果较好的序列，序列如下：siNC:正义链5′-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3；反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3′；siXTP4:正义链5′-UCUGGGUUCCUGCUCU GUUTT-3′；反义链5′-AACGCAGGAACCCAGATT-3′。

1.1.2 试剂：细胞DMEM原液和胎牛血清FBS(Life Technology公司)；青霉素和链霉素(BD公司)；jetPRIMETM(Polyplus Transfection公司)；总RNA提取试剂盒(Omega公司)；兔抗人XTP4抗体(Abcame公司)；抗-GAPDH、山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的重培养与提取：真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A-XTP4由本课题组前期构建成功保存；取菌液加入装有LB液体培养基的试管中，37 ℃摇床250 r/min，12 h过夜摇菌；分别取灭菌处理后的200 mL LB培养基和小摇菌液1 mL于锥形瓶中，37 ℃摇床250 r/min，16 h过夜摇菌；按照中提试剂盒说明书进行转染级质粒的提取；最后将提出的质粒送奥科测序公司进行测序，并与NCBI原序列进行比对。

1.2.2 细胞培养与传代分组处理：将HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于5% CO2孵箱中37 ℃培养；待细胞增殖至汇合度为80%～100%时即可分板处理，分别转染过表达和干扰质粒以及各自的对照质粒，进行后续实验。

1.2.3 Real-time PCR检测基因表达：HepG2培养48 h后,按照试剂盒Total RNA Kit说明书提取细胞中的总RNA(均为RNase-free操作)；将提取的RNA反转录为cDNA后，根据Power SYBR®Green PCR Master Mix说明书检测相关基因在细胞的表达量。

1.2.4 Western blot检测XTP4、snail、NF-κB和MMP- 9的表达：质粒转染后48 h提取细胞总蛋白进行Western blot;取蛋白质样品电泳并转移至PVDF膜，于1×TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭2 h；分别加入相应一抗，4 ℃过夜，1×TBST洗膜3次；加二抗置室温2 h，1×TBST洗膜3次；配制显色液后将膜于成像仪下曝光显影。

1.2.5 细胞划痕愈合实验：6孔板培养细胞，在板底背面用记号笔画平行标记线，待细胞增殖至汇合度为90%～100%时，中号枪头板内画垂直于板底记号线的划痕线，两线交叉点作为观察点，PBS洗掉脱落细胞，换上无血清培养基，拍照测量交叉点“伤口距离”，记为0 h，分别在24和48 h同位点拍照，每组取3个数值，进行比较。

1.2.6 细胞迁移实验：6板培养细胞，干预处理48 h后，胰蛋白酶消化细胞，无血清培养基重悬，Transerll小室(上室滤膜无Matrigel胶包被)上室加入100μL含有5×104个细胞的无血清悬液，下室加入600 μL 20%胎牛血清培养基，于5% CO2， 37 ℃孵箱中培养24、36和48 h，取出24孔板，用棉签擦掉上室未穿过细胞，100%甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min,倒置显微镜高倍视野(×200，5个视野)拍照观察穿膜细胞数量，每组设3个复孔，取平均值，重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 XTP4的重组真核质粒测序正确

重培养pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4质粒序列测序正确，后续实验可用此序列进行XTP4基因过表达。

2.2 XTP4质粒转染后效率鉴定

2.2.1 重组真核质粒过表达效果检测：重组真核质粒 pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4转染细胞48 h后，pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4成功过表达肝癌细胞中XTP4 mRNA(图1A)(P<0.05)；成功增加了XTP4蛋白表达水平(图1B)。

2.2.2 小干扰质粒XTP4 siRNA干扰效果检测：小干扰质粒XTP4 siRNA转染细胞48 h后， XTP4 siRNA成功降低了HepG2中XTP4 mRNA的表达 (图2A)(P<0.01)；成功减少了XTP4蛋白表达水平(图2B)。

2.3 XTP4基因能够促进HepG2迁移

2.3.1 对细胞横向迁移能力的影响:过表达组XTP4的迁移率较对照组增加(P<0.05)，干扰组迁移率低于对照组(P<0.01)，说明XTP4可促进肝癌细胞的迁移侵袭能力(图3)。

2.3.2 对细胞纵向迁移能力的影响:重组真核质粒、小干扰质粒处理的细胞接种上室，24 h后表达组穿膜细胞数多于对照组(P<0.05)(图4A)；干扰组穿膜细胞数较对照组明显减少(P<0.01)(图4B)。

2.4 qRT-PCR和Western blot检测Snail、NF-κB和MMP- 9 mRNA及蛋白的表达

小干扰质粒处理HepG2 48 h后，干扰组Snail和NF-κB的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)(图5)。

A.verification of XTP4 mRNA level in hepatocellular carcinoma cells after XTP4 transfection; B.XTP4 protein level of hepatocellular carcinoma cells after XTP4 transfection; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.XTP4 mRNA level of hepatocellular carcinoma cells with XTP4 small interfering plasmid; B.XTP4 protein level of hepatocellular carcinoma cells with XTP4 small interfering plasmid; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.overexpression of XTP4 gene after the wound healing test, respectively, after the scratch treatment 0,24,48 hours; B.interference of XTP4 gene after the wound healing test, respectively, after the scratch treatment; *P<0.05 compared with control group

3 讨论

XTP4是位于人类染色体17q12上的新基因，位于含有多种基因的“癌热点基因座”中，已证明这些基因参与了癌的发展。XTP4位于HER2扩增子的最小扩增区域内， 介于HER2和GRB7之间， XTP4的开放阅读框编码大小为12.4 ku、表达在细胞膜和细胞质的蛋白质。XTP4在肝癌肿瘤转移生物学中的作用尚未被研究，本课题将研究XTP4对肝癌细胞迁移侵袭的影响。

A.transplantation of XTP4 gene in hepatocellular carcinoma cells was performed in Transwell chamber and 24 hours after taking pictures, the number of cells passing though the cell membrane increased significantly, *P<0.05 compared with control group; B.after silencing the XTP4 gene in hepatocellular carcinoma cells, Transwell test was performed and 24 hours after taking pictures, the number of cells passing thought the cell membrane was significantly decreased; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.Snail mRNA expression; B.NF-κB mRNA expression; C.MMP- 9 mRNA expression; D.NF-κB, MMP- 9 expression at the protein level; *P<0.05 compared with control group

肝癌是一种常见的预后较差的实质性肿瘤。将近90%的肿瘤相关死亡归因于肿瘤的侵袭和转移[4]。肿瘤转移是一个复杂的多步骤连续性过程，由特定信号分子通过控制细胞骨架动力学和细胞间黏附和/或细胞-细胞外基质相互作用的变化途径启动和维持，其中肿瘤细胞的恶性增殖和细胞外基质降解是重要步骤，最终导致细胞向邻近组织迁移和外渗[11]。本课题组前期实验证明XTP4对肝癌的增殖凋亡密切相关，通过大量查询TCGA数据库资料结果表明，XTP4在肝癌组织中呈高表达，在癌旁及正常组织中呈现低表达，可以初步证实XTP4可能为理想的肝癌诊断标志分子。本实验发现，过表达XTP4可以促进HepG2细胞迁移速率增加，干扰XTP4的表达可使HepG2细胞迁移速率减慢，这一发现与先前在前列腺癌细胞中的报道一致[12]。表明沉默XTP4基因在肝癌治疗中有实际应用前景。

NF-κB是重要的可诱导基因转录调节因子，近年来研究表明,NF-κB调节许多黏附、侵袭、迁移相关因子转录而参与肿瘤的侵袭转移，在调控肿瘤转移过程中起着重要的作用，阻断NF-κB信号通路可下调MMP- 9及上调基质金属蛋白酶组织抑制剂- 1、2(TIMP- 1、2)表达。上皮间质转化(EMT)过程被认为参与促进肿瘤侵袭转移过程，近年来陆续发现转录因子Snail是参与EMT调控的重要转录因子，通过与上皮钙黏素启动中区的E2BOX连接基序结合，抑制其的转录表达诱导EMT发生，进而促进多种肿瘤的侵袭转移能力。本研究在肝癌细胞沉默XTP4后,在转录水平检测Snail表达量有所下降，但是在蛋白水平暂时未发现明显改变，还需要进一步的研究，Snail有可能会充当肝癌复发转移的另一个靶向标志物。

综上所述，XTP4通过增加NF-κB的表达发挥基因调控作用,增强MMP- 9基因的转录活性,使MMP- 9表达上调,增加基底细胞膜降解，引发癌细胞的侵袭转移。因此XTP4可能作为肝癌的靶向治疗目标基因，NF-κB和MMP- 9表达的检测可能有助于肝癌侵袭转移的判断。随着XTP4作用机制进一步研究，XTP4有望能在肝癌预测以治疗当中发挥潜在作用。