阿魏酸通过雌激素受体α调控人乳腺癌细胞系的增殖、迁移及侵袭

孙瑛蔚，柯 洪*，赵梓亦，杨玉婷，黄 宁

(成都中医药大学附属医院 1.药剂科；2.科研部中心实验室；3.科研部， 四川 成都 610075)

桃红四物汤发挥植物雌激素的活性被广泛应用于治疗雌激素水平低下或异常引起的妇科疾病[1],可能起到类似雌激素替代疗法的作用。桃红四物汤对乳腺和乳腺癌细胞的基因表达谱具有非常类似的影响，提示它与雌激素的相似作用[2-5]。目前对桃红四物汤等雌激素替代疗法是否会诱发妇科肿瘤存在巨大争议。

不同浓度的雌激素通过乳腺癌细胞表面的雌激素受体，对乳腺癌的增殖、成瘤、迁移和侵袭能力产生影响[6]，低浓度17-β 雌二醇(E2， 1 nmol/L)促进乳腺癌的恶性行为，而高浓度E2(100 nmol/L)则促进乳腺癌细胞凋亡。有报道，复方桃红四物汤，或单味中药熟地、白芍、当归的主要成分之一是阿魏酸，它具有较强的植物雌激素活性，可以刺激乳腺癌细胞的增殖或小鼠子宫发育，这与雌二醇的作用一致[7]。本研究检测了不同浓度阿魏酸对乳腺癌细胞的生理过程的影响及是否依赖于雌激素受体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人乳腺癌细胞系MCF-7和MB231(军事医学科学院，由本实验室保存)。

1.1.2 主要试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清和青链霉素(Hyclone公司)；CCK-8检测试剂盒和RNA提取试剂盒(广州飞克生物科技有限公司)；转染试剂Lipofectamine 2000和RT-qPCR试剂盒(Life Technology公司)；靶向雌激素受体α(ERα)的shRNA、负对照shRNA、实时荧光定量PCR引物：ERα上游引物:5′-CCCACTCAACAGCGTGTCTC-3′和下游引物:5′-CGTCGATTATCTGAATTTGGCCT-3′；MALAT-1上游引物:5′-GCTGTCTACTTACCACCAAAGG-3′和下游引物:5′-GTCCCAGCTCTCATCTTCACC-3′；β-actin上游引物:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′和下游引物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(广州复能公司合成)；ERα、β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗(Abcam公司)；阿魏酸、BCA蛋白定量试剂盒(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染：培养乳腺癌细胞MCF-7和MB231于补充了10%胎牛血清、1%青/链霉素的RPMI1640培养基中，置于37 ℃充以5% CO2细胞培养箱中。每2～3 d换液1次；当细胞汇合度达到80%～90%时，用胰蛋白酶消化传代。细胞分成4组，包括1)空载体组(LV-vector)；2)过表达组(LV-ERα)；3)干扰负对照组(LV-shScrambled)；4)干扰组(LV-ERαKD)，n=3。转染前24 h，按5×105个/孔细胞接种在6孔板中贴壁过夜；每孔用1.6 μg shRNA进行转染。参照Lipofectamine 2000说明书进行转染。转染6 h后，用完全培养基替换转染用培养基。48 h后，收集细胞用于后续检测。

1.2.2 划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力：进行划痕实验时，将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达到100%，用白色移液器枪头按固定角度在板底划痕，并用记号笔记录拍照位置，在划痕后的0和24 h分别拍照，比较划痕的愈合速度。Transwell小室法实验按如下步骤进行：在Transwell小室上层加入40 μL Matrigel胶，并室温放置4 h凝固。上室中加入200 μL(2×104个/mL)含细胞培养基，下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，作为去化因子，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。24 h后，取出小室，4%多聚甲醛室温固定10 min，0.1%结晶紫染色10 min，使用棉签去除滤膜表面未穿膜细胞，光镜下照相。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活性：细胞中加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃放置2 h，用分光光度计计算620 nm处的吸光度值。

1.2.4 RT-PCR检测ERα，MALAT-1 mRNA：根据反转录试剂盒说明书提取细胞总RNA，并进行反转录，得到目的细胞的总cDNA。分别扩增目的基因ERα、MALAT-1和对照内参β-actin。扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；每个循环95 ℃变性10 s，60 ℃退火及扩增1 min，循环40次。记录每组样品的扩增CT值，将β-actin作为内参基因用2-△△Ct法计算相对表达水平。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达：收集目的细胞并抽取总蛋白，用BCA法定量总蛋白浓度，并加入蛋白上样缓冲液将蛋白调节至1 mg/mL。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离20 μg蛋白样品，120 V，60 min；PVDF半干转膜20 V，30 min；5%小牛血清白蛋白室温封闭30 min，加入一抗(1∶1 000稀释)，室温孵育2 h；用冰浴的PBS清洗3次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶ 5000稀释)，室温孵育30 min；用含0.1% Twen20的PBS清洗3次；Bio-Rad凝胶成像系统低价ECL显影液显影，以β-actin作为内参蛋白。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 阿魏酸抑制MCF-7细胞增殖、成瘤、迁移和侵袭活性的影响

阿魏酸显著抑制MCF-7细胞的增殖活性(图1A)和软琼脂成瘤能力(图1B);2.5 mmol/L阿魏酸也明显抑制了MCF-7细胞的迁移和侵袭能力明显增强(图1C,D)。

MCF-7 or MB231 cells were incubated with ferulic acid; A.CCK-8 assay was performed to detect cell proliferation after co-incubation with ferulic acid for 24 and 48 hours, *P<0.05 compared with mock group after 24 hours exposure; △P<0.05 compared with mock after 48-hour exposure;B.detection of the colony formation of MCF-7 and MB231 cells exposed to ferulic acid,*P<0.05 compared with mock group after 24-hour exposure; C.scratch assay was performed to detect the effects of ferulic acid on migration ability of MCF-7 cells, *P<0.05 compared with mock group after 24 hours exposure; D.Transwell assay was performed to detect the effects of ferulic acid on invasion ability of MCF-7 cells, *P<0.05 compared with mock group after 24 hours exposure

2.2 阿魏酸依赖于雌激素受体促进乳腺癌细胞活力

LV-ERαKD对MCF-7细胞中ERα表达量的干扰作用有效(图 2A)。ERα表达量下调后，阿魏酸对MCF-7细胞的增殖促进作用减弱(图2B)。LV-ERα对MB231细胞中ERα的过表达作用有效(图2C)。ERα过表达后，阿魏酸对MB231细胞具有促进活力(图2D)。

2.3 阿魏酸影响细胞内的MALAT-1 mRNA。

阿魏酸显著增加了MCF-7细胞中MALAT-1 mRNA水平，但对MCF-7-ERαKD细胞无效(图3A)。在过表达了ERα的MB231细胞中，阿魏酸处理显著增加了MALAT-1的表达水平；其对MB231细胞并无效(图3B)。

3 讨论

由于雌激素含量异常引起的妇科疾病，主要采用补充外源性的雌激素替代疗法(estrogen replace-ment treatment，ERT)和服用补充植物雌激素的桃红四物汤[8]。补充植物雌激素可减少女性绝经后骨质疏松、冠心病和高血压的发病率，也可治疗雌激素水平低引起的月经不调等妇科疾病。目前对长期补充雌激素尚存在争议，有报道补充雌激素会显著增加罹患妇科肿瘤的概率[9]，但也有研究者发现这种疗法可以减少妇科肿瘤的发生[10-11]。

本研究主要探究了桃红四物汤的主要成分之一，阿魏酸对乳腺癌细胞系MCF-7和MB231增殖、体外成瘤、迁移及侵袭能力的影响，及其与细胞表面雌激素受体的关系。结果表明，阿魏酸对乳腺癌细胞MCF-7的增殖，体外成瘤，迁移及侵袭能力均具有促进作用，而对MB231细胞则无明显影响。通过基因干扰技术和过表达技术，发现雌激素受体对阿魏酸对乳腺癌细胞生理状态的影响是关键。植物雌激素与雌二醇类似，与雌激素受体(α/β)结合后接到了复合物的细胞核定位并启动其转录活性[12]。本研究探讨了涉及雌激素受体α的调控机制而未关注雌激素受体β，是因为MCF-7细胞中雌激素受体α是主要存在和功能形式[6]。

Lentiviral vector was performed to knockdown or overexpress ERα followed by cell viability assays; A.after 72 hours of infection, RT-qPCR and semi-quantitative Western blot were performed to confirm the knockdown of ERα in MCF-7 cells; B.after ERα knockdown, cell viability was evaluated every 24 hours for 5 days,data represent means±SD(n=3), *P<0.05; C.after 72 hours of infection, RT-qPCR and semi-quantitative Western blot were performed to confirm the overexpression of ERα in MB231 cells; D.after ERα overexpression, cell viability was evaluated every 24 hours for 5 days; data represent means±SD (n=3), *P<0.05 compared with LV-vector group

After ERα knockdown or ERα overexpression, the effects of ferulic acid on MALAT-1 expressing level were measured by RT-qPCR; A.MALAT-1 expressing level in MCF-7-vector and MCF-7-ERαKD after ferulic acid treatment was measured; B.MALAT-1 expressing level in MB231-vector and MB231-ERα after ferulic acid treatment was measured; *P<0.05 compared with LV-vector group

意外的是，不同浓度的阿魏酸具有类似的调控趋势，即促进乳腺癌细胞的恶性行为。这与雌激素依赖于不同浓度的乳腺癌细胞调控作用不一致[6]，可能是因为阿魏酸的主要作用成分浓度不够所致。后续实验有必要提高阿魏酸中的有效成分以探讨其对乳腺癌细胞的调控是否具有浓度依赖性。