高频电疗对急性脊髓损伤大鼠神经功能恢复和BDNF-TrkB表达的影响

周刚，王佳君

（湖北省黄冈市中心医院神经内科，湖北 黄冈 438000）

近年来随交通运输及建筑业发展，急性脊髓损伤（Acute spinal cord injury，ASCI）发生率呈上升趋势[1]。目前尚无治疗ASCI的理想方法，给患者家庭及社会带来沉重负担，其治疗处于多途径多学科探索阶段。高频电场疗法（简称高频电疗）是一种应用波长为10-100 m的超高频交流电作用于生物体，以达到治疗目的。有基础研究表明[2]，高频电疗可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能，抑制Caspase3及海马神经细胞凋亡，减轻神经元超微结构损伤，而发挥脑保护作用，但在ASCI中应用较少。本文应用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型，观察高频电疗法（无热量短波、超短波、微波）对其神经功能恢复及损伤段脊髓BDNF-TrkB表达的影响，为ASCI的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级成年雌性SD大鼠75只，均10周龄，体重22-24 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，在20-22℃、50%-60%湿度下饲养1周，自由进食和饮水，动物生产许可证号：SCXK（泸）2013-0016。

诱捕早春出蛰活动的成虫。可在院内按一定距离投放废笋，一般上午8时～9时投撒，下午1时～2时收集捕杀。幼虫活动性差，爬行缓慢，成虫在清晨也很少飞翔，在其捕食为害时极易扑捉，利用成虫的假死性用网虫扑杀效果也较好。

1.2 主要仪器 手术器械，注射器，微细咬骨钳，modelⅠ型NYU脊椎冲击损伤仪（美国新泽西州立大学神经科学联合中心）；日本伊藤SW180短波治疗仪，南京产微波治疗仪MTC-3-500，UWM-02型超短波治疗仪（日本丸高）；石蜡切片机（德国莱卡），数显恒温漂片仪（常州中威），全自动HE染色机（丹麦 Dako），台式高速离心机 （德国 Eppendorf），Olympus BX41显微镜（日本Olympus）等。

1.3 主要试剂 抗BDNF兔源单克隆抗体（美国ABcam公司）；抗TrkB兔源多克隆抗体（美国Millipore公司）；DAB显色液（DAko）。

计算出d(Ei,Ej)后，再计算两证据之间的相似度Sij=1-d(Ei,Ej)(i,j=0,1,2，…，k)，得到相似度矩阵S。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料以（±s）表示，所有数据均经软件检验呈正态性分布且方差齐性，行t检验，服从正态分布各变量间相关性采用Spearman相关分析、以相关系数r表示两资料间的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 Zea-Longa评分比较 随时间延长，损伤各组评分均降低，但损伤各组各时点Zea-Longa评分均高于 S1组（P＜0.05）；各时点 S2、S3 组 Zea-Longa评分低于S4、S5组，且S3组各时点Zea-Longa评分低于S2组，2周、3周时S4组Zea-Longa评分低于S5组（P＜0.05）。见表 1。

1.4.3 干预治疗 治疗前均排空尿液，将其俯卧位固定在自制木制槽型装置，在造模后1 d对损伤部位进行治疗。S2组给予无热量短波（频率27.12 MHz，鼓形辐射器直径7 cm）照射治疗，辐射器垂直置于伤口上方及皮肤间隙2-3 cm，选择连续输出，照射强度10W，10min/次，1 次/d，照射至取材前 1 d；S3 组给予超短波治疗，两电极板对置于大鼠损伤区脊髓两侧，电极板与脊髓皮肤间隙2-3 cm，选择第1档输出功率，照射强度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S4组给予微波治疗（频率2450 MHz，辐射器直径10 cm），辐射器垂直置于伤口上方及皮肤间隔8 cm处，连续输出，照射强度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S1组仅切除低T10胸椎及其上下棘突与椎板，不进行脊髓打击，不进行物理因子治疗；S5组在ASCI造模成功后不给于损伤部位物理因子干预。

1.4.2 ASCI模型制备 应用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型。按0.33 ml/100 g的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以T10棘突为中心备皮，将大鼠俯卧位固定在手术板上，以碘伏消毒，铺无菌洞巾。沿T10中心在背部正中切开皮肤，逐层分离筋膜肌肉，后将T9-T11棘突与两侧椎板充分暴露，咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓背侧硬膜，确保硬脊膜完整。应用NYU脊椎冲击损伤仪在自硬脊膜25 mm高处自由垂直落下撞击T10段脊髓硬脊膜，撞击能量25 mm×10 g，损伤直径2.5 mm。打击后大鼠身体痉挛性颤动，尾巴出现痉挛性摆动，双后肢及躯体回缩样扑动，双后肢弛缓性瘫痪，且硬膜表面充血水肿，即表明造模成功。术毕，无菌生理盐水冲洗伤口，缝合，棉布巾覆盖保温，苏醒后放回笼中饲养。在后肢肌注青霉素G20万U预防感染，并人工挤压膀胱协助排尿。S1组（假手术组）仅单纯咬除T9-T11段椎板、棘突，而不损伤脊髓。

上述研究表明，跨文化交际学的“修辞转向”重申了通过承认不同主张、文化或个体来建立一个和谐社会或世界，而不是对文化差异摆出不加分辨的宽容态度的重要性。

1.5.1 采用Zea-Longa五级评分法评估神经功能，0分：无神经功能缺失症状；1分：不能完全伸展左前肢，轻度局灶性神经功能缺失；2分：向左侧转圈，中度神经功能缺失；3分：向左侧倾倒，重度神经功能缺失；4分：不能自发行走，意识水平低，评分越高代表神经功能损伤越严重。于术前、脊髓损伤后1d、1周、2周、3周进行双盲法评分。

1.5 观察指标

1.2.3 感官评价。参考其他水产品的感官评定标准[7]，制定克氏原螯虾的感官评定标准。由6名经过训练的感官评定人员进行，按照表1进行综合评分。在克氏原螯虾冻结后0、10、20、30、40、50、60 d进行色泽、体表、肌肉及90 ℃水煮5 min 的气味和汤汁评价。总分值在10分(最好品质)和0分(最差品质)。

1.5.2 BDNF、TrkB测定 ①取材及切片制备：于神经功能评分同时点取材，以10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，动物麻醉后断头，排空血液，打开暴露脊髓，剪取损伤区尾端L2-L5段脊髓组织，置于10%中性甲醛中固定；②经脱水、石蜡包埋、连续切片后，采用BDNF、TrkB试剂盒行免疫组化染色，中性树脂封片保存，以PBSA代替一抗作阴性对照，以相应的阳性对照切片作阳性对照，在显微镜下（400×）观察阳性细胞数（棕黄色），并拍照，以单个视野中阳性细胞数量进行统计学分析。

1.4 实验动物分组与处理

2 结果

1.4.1 分组 将75只大鼠随机分为S1、S2、S3、S4、S5五组，各15只。

表1 Zea-Longa评分比较（，分，n=15）

2.2 损伤各组BDNF、TrkB细胞阳性数比较 损伤1周时各组BDNF、TrkB细胞阳性数达高峰，且S3组最高，S2组次之，S4、S5 组低于 S2、S3 组（P＜0.05）；随后均下降，2周时S2、S3组高于S4、S5组，S3组高于S2组（P＜0.05）；3周时S5组低于初始水平，且S2、S3、S4组高于 S5组，S3组高于 S2组、S4组（P＜0.05）；损伤 1d、1周、2周 S4组 BDNF、TrkB 阳性细胞数与S5组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、表 3。

表2 损伤各组BDNF细胞阳性数比较（±s，个/视野，n=15）

表2 损伤各组BDNF细胞阳性数比较（±s，个/视野，n=15）

注：与同组损伤1d比较，①P＜0.05；与S2组同时点比较，②P＜0.05；与S3组同时点比较，③P＜0.05；与S4组同时点比较，④P＜0.05。

组别 1d 1周 2周 3周S2 5.64±0.62 13.16±1.15① 10.13±1.12① 6.64±0.71①S3 5.63±0.64 16.10±1.63①② 12.44±1.35①② 7.83±0.91①②S4 5.65±0.63 10.25±2.06①②③ 8.13±1.21①②③ 5.89±0.74①②③S5 5.66±0.63 9.82±0.99①②③ 7.91±0.85①②③ 5.19±0.62①②③④

表3 损伤各组TrkB细胞阳性数比较（±s，个/视野，n=15）

表3 损伤各组TrkB细胞阳性数比较（±s，个/视野，n=15）

注：与同组损伤1d比较，①P＜0.05；与S2组同时点比较，②P＜0.05；与 S3组同时点比较，③P＜0.05；与 S4组同时点比较，④P＜0.05。

组别 1d 1周 2周 3周S2 6.35±1.20 15.69±1.61① 10.56±1.17① 6.69±0.71①S3 6.32±1.23 19.88±2.10①② 12.89±1.34①② 7.35±0.75①②S4 6.34±1.21 12.56±1.31①②③ 8.99±0.91①②③ 6.53±0.58①②③S5 6.36±1.18 11.37±1.24①②③ 8.54±0.86①②③ 5.40±0.57①②③④

2.3 Zea-Longa评分与 BDNF、T rkB相关性分析ASCI大鼠损伤后3周内，Zea-Longa评分与BDNF、TrkB阳性率呈负相关（P＜0.05）。见表4。

表4 Zea-Longa评分与BDNF、TrkB相关性分析

3 讨论

ASCI是临床较严重的创伤性疾病，机体在外力、机械力所致的原发性损伤后，脊髓周围结构局部缺血、出血、微循环损伤，继而导致继发性损伤，给临床治疗带来严峻挑战。动物及人体研究表明[3-4]，脊髓损伤后即使未经治疗，缺损的神经功能也可部分恢复，证实脊髓存在一定的可塑性，这也提示临床在治疗ASCI时可由神经保护转向促进神经再生，即促进神经元存活及替换，通过轴突再生与重塑而建立新的神经回路，部分代偿丧失的神经功能。高频电疗是以生物体在高频磁场中可表现出导体、电容、电介质、线圈等性质的原理的物理疗法，治疗时电极板发出高频电磁波，产生震荡电磁场，带电离子在电场强度最大瞬间向磁场方向伸展，在电场强度最小瞬间离子又恢复原状，当电磁波连续或脉冲式作用于生物体时，可产生电流，发挥热效应或非热效应，当电场频率适当时，细胞受到刺激而引起生物学作用，其中最常见的为短波、超短波、微波，研究证实对神经损伤后的修复与再生有确切疗效，但目前在ASCI中应用较少[5]。

本次研究结果显示，随着时间延长，损伤各组评分均降低，但损伤各组各时点Zea-Longa神经功能评分均高于S1组，而S2、S3组在各时点Zea-Longa评分优于S4、S5组，2周、3周时 S4组 Zea-Longa评分低于S5组，但S5组损伤后1-3周Zea-Longa神经功能评分较同组损伤1d呈下降趋势，提示ASCI后，神经功能是一个自我恢复的过程，而采用高频电疗对神经功能损伤有较好的修复作用，缩短恢复时间，使神经功能尽快恢复，但微波疗法不宜过早使用，且剂量应小，这与Pang等[6]通过研究得出的结论相近。BDNF为神经营养因子家族重要成员，通过旁分泌或自分泌作用与邻近细胞膜特异性受体TrkB结合而促进神经元存活、增殖，突出其可塑性作用，继而促进中枢神经系统损伤后轴突再生与修复[7-8]，Zhou等[9]的研究结果表明BDNF可能通过与其受体TrkB结合，而启动众多信号通路传导，发挥其促进神经功能修复的作用，可见BDNF、TrkB在ASCI神经系统修复及肢体运动功能改善方面起着重要作用。本次研究结果显示，损伤1周时各组BDNF、TrkB细胞阳性数达高峰，且S3组最高，S2组次之，S4、S5组低于S2、S3组，在损伤后1-2周时这种差异最明显，而在3周差异趋势减小，甚至在3周时S5组低于初始水平，而S2、S3、S4组BDNF、TrkB阳性细胞数维持在较高水平，此外相关分析显示 ASCI大鼠损伤后 3周内，Zea-Longa评分与BDNF、TrkB阳性率呈负相关，这与谢财忠等[10]的研究结果相似，提示无热量短波或超短波可较好调动内源性BDNF合成增加或转运增加，促进局部运动及感觉神经元的存活、轴突生长，阻止神经元死亡、促进其存活与修复；微波也能刺激BDNF-TrkB表达，加快脊髓神经功能恢复，但效果较短波或超短波弱，考虑与微波超高频电磁场中发生振荡较短波、超短波更为剧烈，偶极子旋转、有极分子摆动过于剧烈有关，对尚处于损伤急性应激刺激阶段的脊髓来说可能是不利的。

综上所述，高频电疗可明显改善ASCI大鼠神经功能，促进神经功能恢复，可能通过上调BDNF-TrkB表达而发挥作用。

叶总接过话茬：“这么看来，我猜的就八九不离十了。老贾成功骗过我们之后，就剩下钓你教授上勾了。那天我提前离开酒席之后，他怕夜长梦多，便用钱盒子为饵，促成交易。仔细想想，看来老贾真的是以为这个盒子不太值钱，所以才把它当陪衬送给了陆教授。”