苦瓜中黄酮类物质提取及生物活性分析

葛雅琨，张 臻，张元新

(吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林 132022)

苦瓜的果实营养丰富，药食兼用.据现代营养学分析，苦瓜中富含蛋白质、糖、VA、VB、VC及各种必需氨基酸等[1].苦瓜素有“药用蔬菜”之称[2,3]，因其不仅有良好的食用价值，而且还有明显的药用功能而得名.中医认为，苦瓜的全株均可作为药材使用，历代临床应用治疗肿瘤、痢疾、肠炎、中暑等症状.《本草纲目》中记载：苦瓜“苦寒、无毒、除邪热、解劳乏、清心明目、益气壮阳”.现代研究证明，苦瓜具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗生育、免疫调节等生物学活性.

苦瓜能作为药用食材与其中所含的黄酮类物质密不可分.黄酮类化合物是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物[4].如白果双黄酮和葛根总黄酮等[5],对心血管疾病有治疗作用；木犀草素、羟基芫花素和杜鹃素等能治疗气管炎；竹叶黄酮具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫调节、抗菌等生物学功效.这些在人类的营养、健康和疾病防治上有着广阔的应用前景[6，7].本实验研究从苦瓜中提取黄酮类物质的方法，并利用体外抑菌实验[8,9]对其生物学活性进行分析.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

苦瓜，购买自超市；大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)购买于中国普通微生物学菌种保藏管理中心.

1.2 实验过程

1.2.1 制备冻干粉

制备冻干粉的方法如下：

(1) 用手术刀先将苦瓜横切成两半，取出其中的苦瓜籽和苦瓜瓤.然后将其切成1.5～2 cm宽的苦瓜条.

(2) 将切好的苦瓜条放入烧杯中，然后将其放置于-40 ℃的冰箱中保存6～8 h左右.

(3) 取出冻好的苦瓜条，放在大托盘中，用手术刀将苦瓜条切片，每片的厚度大约在1～2 mm之间.

(4) 将切好的苦瓜片平铺在冻干机托盘上，铺好的苦瓜片尽量紧凑，但是应避免苦瓜片的重叠；之后将其继续放置于-40 ℃的冰箱中过夜保存.

(5) 将苦瓜片用冷冻干燥机进行冻干.

(6) 将冻干后的苦瓜片转移至研钵中，研磨成粉末.

(7) 将研磨过的粉末过60目筛，苦瓜粉装入50 mL的EP管中，用石蜡膜封口，做好标记并放于-20 ℃的冰箱中保存；并将未能过滤的苦瓜片放入研钵中继续研磨，直到苦瓜粉完全通过筛子为止.

1.2.2 粗提

分别用丙酮和75%的乙醇溶液作为溶剂，采用固液浸提法、超声波提取法、超声法与浸提法混合的方法和索氏提取法等多种不同的方法对苦瓜粉中的黄酮类进行初步的提取.此外，对各种方法都进行了3组不同的温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃)作为对照，以便选择出最佳的提取方法及最佳的温度.

1.2.3 测定粗提物的黄酮含量

用分光光度计法[10-12]测出芦丁标准品在各浓度下的吸光度，并用同种方法测量各种方法得到的浓缩液，以及各浓缩液稀释两倍后的吸光度.

1.2.4 高效液相色谱法检测

将测得吸光度最大的两组粗提物通过滤膜过滤后吸取20 μL，注入高效液相色谱仪中分别进行检测，30 min后得到图谱.

1.2.5 分离纯化

将5 ml黄酮浓度最高的粗提液加入到具有聚酰胺树脂的分离柱中，然后用30%，50%，70%，90%的乙醇溶液依次进行洗脱，各得50 mL，并将洗脱液浓缩到5 mL.

1.2.6 生长曲线测定

(1) 配置LB液体培养基，分别取10 mL装入7支试管中并用呼吸膜封口.

(2) 采用高压蒸气法对其进行灭菌(121 ℃，20 min).

(3) 在无菌操作下，取50 μL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌加入6支试管中(每种菌两支试管)，并做好标记，金黄色葡萄球菌记为1、2，大肠杆菌记为3、4，而铜绿假单胞菌则记为5、6，7号为空白试管.

(4) 在1、3、5加入200 μL的浓缩液(测得抑菌圈最大的一组所采用的方法得到的)，向2、4、6号试管中加入等体积无菌水作对照并套上呼吸膜.

(5) 摇匀后将7支试管放在37 ℃，130 r/min的摇床上培养.

(6) 1 h后，取出试管后，在无菌环境下，从7支试管中分别用移液枪吸取200 μL液体加入96孔板中(尽量使移液枪在各支试管的同一位置吸取).

(7) 再向前六支试管中分别补加200 μL的灭菌后的培养液，7号弃用，套上呼吸膜后将6支试管放入摇床中继续培养.

(8) 将96孔板放入酶标仪中，测量600 nm的吸光度，7号为空白样.

(9) 重复步骤(5)、(6)、(7)、(8)依次测2、4、6、8、24 h后的吸光度，并做好记录.

1.2.7 黄酮的定性测定

(1) 盐酸-镁粉反应：取适量待测样品置于试管中，加少许镁粉振荡，滴加4～5滴的浓盐酸，水浴加热2 min，观察、记录颜色变化.

(2) 氨熏试验：取适量待测样品于滤纸片上，稍干，置于浓氨水瓶口熏30 s，观察颜色变化.

2 结果与讨论

2.1 不同提取剂提取总黄酮含量

以芦丁为标准品测定其在510 nm处的标准曲线，用以衡量提取物中总黄酮的含量.芦丁的标准曲线如图1所示.

芦丁浓度/(g·mL-1)图1 芦丁标准品吸光度

在不同提取剂作用下，1 g苦瓜粉的提取浓缩液稀释20倍后，测得吸光度以及经计算得出的总黄酮含量如表1、2所示.结果表明，以75%的乙醇为提取剂时，60 ℃时浸提与超声相结合的方法最佳；以丙酮作为提取剂时，70 ℃索氏提取和60 ℃时浸提与超声相结合的方法最佳；而索氏提取存在的缺陷是，由于丙酮在70 ℃时已达到沸点，由于其密封效果不好，丙酮挥发较多导致浓度相应的提升，并且扩散到空气中对人体也存在一定的损伤.所以应选取60 ℃时，浸提与超声相结合的方法作为最佳提取方法.以下实验所用提取物均是以这种方法提取得到的.

表1 不同温度及不同方法75%乙醇提取的总黄酮含量及其吸光度

表2 不同温度及不同方法丙酮提取的总黄酮含量及其吸光度

2.2 对提取物成分进行定性分析

(1) 盐酸-镁粉反应显示，各级提取物呈现不同程度的紫红色，即：各级提取物中均含有黄酮类物质.

(2) 氨熏试验结果显示，紫外灯下，各级提取物在滤纸上呈现不同程度黄褐色荧光斑点，也就是在各级提取物中均含有黄酮类物质.

(3) 采用高效液相色谱法将提取物浓缩液中的总黄酮进行定性分析.

如图2所示，将两种浓缩液所得图谱与分别用芦丁和槲皮素标准品的图谱所对照可发现，粗提物中不含有(或较少量含有)类似芦丁和槲皮素这两种黄酮类物质，所以，提取物中的黄酮类物质可能是其他类别的黄酮类物质，还有待于进一步研究.

a.以75%乙醇为溶剂浓缩液的色谱图

b.以丙酮为溶剂浓缩液的色谱

c.芦丁标准品的色谱

d.槲皮素标准品的色谱图图2 高效液相色谱图

2.3 丙酮和75%乙醇初步提取物的抑菌效果

选取丙酮和75%乙醇提取物，作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌,测定其生长曲线，结果如图3所示.对大肠杆菌的生长曲线来说，丙酮和75%乙醇的提取液对其产生的抑制作用比较微弱；对金黄色葡萄球菌来说，两种提取液对其都具有抑制作用，并且抑制效果比较接近；而这两种提取液对铜绿假单胞菌具有较强的的抑制效果，而丙酮作为提取剂对其抑制作用最好.

培养时间/ha.不同提取物作用于大肠杆菌

培养时间/hb.不同提取物作用于金黄色葡萄球菌

培养时间/hc.不同提取物作用于铜绿假单胞菌图3 不同提取物作用下大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)和铜绿假单胞菌(c)的生长曲线

2.4 聚酰胺分离产物对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果

分别将75%乙醇和丙酮提取物浓缩液进行聚酰胺树脂分离，以30%，50%，70%，90%乙醇溶液洗脱，得到4种不同浓度的洗脱液，浓缩后，测定其对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长曲线的影响，鉴于2.3的实验结果，初步提取物对大肠杆菌的抑菌作用一般，所以本实验中不再对大肠杆菌进行研究.分离后的提取物作用于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的实验结果见图4、图5.

由图4可以看出，丙酮提取物经聚酰胺分离后，以70%乙醇洗脱得到的物质能最大程度的抑制金黄色葡萄球菌的生长.

图4 聚酰胺分离后不同洗脱液作用于金黄色葡萄球菌

由图5可以看出，同样是丙酮提取物经聚酰胺分离后，以70%乙醇洗脱得到的物质能最大程度的抑制铜绿假单胞菌的的生长.相比较丙酮提取物而言，75%乙醇的提取物经聚酰胺分离后也是70%乙醇洗脱得到的产物抑制两种菌的效果最好，但是均不及丙酮提取物经聚酰胺分离后，70%乙醇洗脱得到的抑菌效果好.这可能显示了在本实验条件及方案下，丙酮作为提取剂，对抑菌有效成分的提取优于75%的乙醇提取剂，但是所提取的具体有效成分，还有待于进一步研究.

图5 聚酰胺分离后不同洗脱液作用于铜绿假单胞菌

3 结 论

(1) 以丙酮和75%的乙醇为提取剂时，采用60 ℃，浸提与超声相结合的方法提取总黄酮效果最佳；

(2) 定性分析结果显示提取液中含有黄酮类物质，但是HPLC分析结果表明，所提取的黄酮类物质结构不同于芦丁和槲皮素；

(3) 抑菌试验显示丙酮和75%乙醇的提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌来说，抑菌作用大肠杆菌<金黄色葡萄球菌<铜绿假单胞菌，而且丙酮作为提取剂对铜绿假单胞菌的抑制作用最好；

(4) 粗提取经聚酰胺分离后，70%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌效果最好，揭示其包含有效的抑菌成分.