鲢鱼酶解物对冻融鱼糜制品品质及其蛋白质体外消化率的影响

刘永乐田苗苗李向红俞 健王发祥王建辉黄轶群

LIU Yong-le1,2 TIAN Miao-miao1,2 LI Xiang-hong1,2 YU Jian1,2 WANG Fa-xiang1,2 WANG Jian-hui1,2 HUANG Yi-qun1,2

(1. 长沙理工大学食品与生物工程系，湖南 长沙 410114；2. 湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙 410114)

(1. Department of Food and Biological Engineering, School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha, Hunan 410114, China; 2. Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Changsha, Hunan 410114, China)

中国淡水鱼产量居世界首位，2016 年，淡水鱼总产量达2 815.54万t[1]。但是，淡水鱼土腥味重、肌间刺多、贮运加工过程中蛋白质容易冷冻变性等，导致贮藏保鲜难、加工率低。目前，将淡水鱼加工成冷冻鱼糜及制品是淡水鱼深加工及提高其加工率的重要途径。鲢鱼为中国四大家鱼之一，2017年产量达450.66 万t，仅次于草鱼[1]，是中国冷冻鱼糜加工的主要淡水鱼品种。

防止鱼肉蛋白质冷冻变性是冷冻鱼糜储运及加工过程重点关注的课题。鱼肉蛋白质的主要组分——肌原纤维蛋白在冻结或冻藏过程中冰晶的形成会导致蛋白质极性基团周围的水化层破坏，蛋白质变性(折叠展开或聚集)及功能丧失，导致鱼糜产品凝胶强度下降；长期冻藏导致鱼糜色泽发暗、持水力下降、凝胶强度降低、口感和风味劣化[2-3]。工业上冷冻鱼糜生产中多选用糖类(如蔗糖和/或糖醇)作为抗冻剂缓解蛋白质冷冻变性[4]，然而糖类抗冻剂会导致产品带有明显甜味，热量值增加，对消费者吸引力下降。

包括本课题组的一些研究已经发现鱼的酶解产物是一种潜在的新型抗冻保护剂，能有效防止鱼糜及其制品在冻藏过程中的凝胶结构劣变[5]；而且鱼酶解产物兼具较好的抗氧化性[6-7]，能防止鱼糜制品的氧化劣变。Cheung等[8]研究也发现冷冻鱼糜中添加太平洋鳕鱼酶解产物后，相比添加商业抗冻剂，其压榨失水率(Expressible moisture)和蒸煮损失(Cooking loss)降低，冻藏对鱼糜食用品质的影响有所缓解。相较于糖类抗冻剂，鱼类酶解产物用于冷冻鱼糜加工中可避免甜味的产生；其丰富的游离氨基酸、短肽等可增加产品的营养价值。

迄今为止，关于鲢鱼酶解产物对冷冻鱼糜及制品食用品质的影响研究尚未见诸于报道，因此，在课题组前期研究的基础上[5]，本研究拟选择复合蛋白酶水解鲢鱼制备抗冻效果最佳的酶解产物组，综合评价添加不同量鲢鱼酶解产物的鱼糜制品冻融前后食用品质(蒸煮损失、凝胶强度、全质构、白度、持水性)及蛋白质体外消化率等的变化，旨在为鲢鱼酶解产物在工业上应用于冷冻鱼糜及其制品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜白鲢鱼：购于长沙理工大学高云市场；

复合蛋白酶：1.2×105U/g，丹麦诺维信公司；

肠衣：直径50 mm，食品级塑料透明肠衣，河北省保定市顺平县唯新肠衣有限公司；

氢氧化钠、硫酸铜等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：BL-9205B型，日本岛津公司；

紫外可见分光光度计：UV-2102PC型，上海棱普仪器仪表厂；

生物酶反应器：100 M型，上海保兴生物设备工程有限公司；

冷冻干燥机：SCICENTZ-10NS型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

低速台式大容量多管离心机：TDL-36C型，上海安亭科学仪器厂；

恒温水浴锅：DK-98-Ⅱ型，天津泰斯特仪器有限公司；

通用台式马弗炉：ZY328004型，美国Thermo公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司；

质构仪：TA·XTplus型，英国Stable Mico System公司；

电子鼻：PEN3型便携式，德国AIRSENSE公司；

测色色差计：WSC-S型，上海物理光学仪器厂；

手持均质机：DS-1型，上海标本模型厂；

1.2 方法

1.2.1 酶解产物的制备 课题组[5]前期研究发现，鲢鱼采用复合蛋白酶水解30 min获得的酶解产物抗冻效果较佳，因此本试验根据前期获得的最优条件制备了酶解产物，具体方法如下：

新鲜鱼肉→去鳞、头尾内脏及骨刺→切块、绞碎→称取碎肉→加蒸馏水[料液比1∶5 (g/mL)]→充分分散→加复合蛋白酶酶解30 min(恒定温度50 ℃、pH 值6.7)→灭酶(80 ℃，15 min)→冷却至室温→离心→上清液冷冻干燥→酶解产物

1.2.2 酶解产物常规成分的检测

(1) 蛋白质的测定：凯氏定氮法[9]。

(2) 水分的测定：直接干燥法[10]。

(3) 灰分的测定：干法灰化法[11]。

1.2.3 鱼糜制品的制备 新鲜鲢鱼在低于4 ℃环境中剔除鱼骨鱼皮鱼刺，白肉用4 ℃蒸馏水冲洗，切成小块斩拌5 min，在0～10 ℃下加入2.5%食盐，2%淀粉斩拌5 min，然后分别添加不同量酶解产物(0%，2%，4%，6%)和商抗至鱼糜中，在10 ℃以下斩拌混匀5 min后灌肠成型。成型后一组进行冻融循环，一组进行凝胶化处理，凝胶化处理：40 ℃水浴锅保持30 min后90 ℃蒸煮20 min，冷却后置于4 ℃条件冷藏过夜后测量；冻融循环组在6次冻融循环后凝胶处理，方法如上。上述试验过程重复3次。

2.1 确立项目 在项目学习中，第一步是要确定项目(课题)。“二考”复习中项目的确定应该根据课程标准、《浙江省普通高中学科教学指导意见·生物》和《浙江省普通高中学业水平考试暨高考选考科目考试标准(2014版)》，以及教学内容和学生已有的知识及经验。项目可以是环境保护、人体健康等方面密切相关的社会性议题，也可以是学生身边需要解决的生活和生产实践问题。在确定项目时，该项目是否包含了生物学主干知识，是否涵盖了学科核心素养，是否贴近学生的生活，是否来源于社会生产实践，是否真实且有意义，学生是否感兴趣，是否具有可操作性等，都是需要考虑的问题(图1)。

1.2.4 蒸煮损失 根据Yang等[12]的方法略做修改，将鱼糜凝胶切成凝胶圆柱体并称重后放入蒸煮袋内且封口，置90 ℃ 水浴锅蒸煮20 min。蒸煮结束擦干水分后称重。蒸煮损失按式(1)计算：

(1)

式中：

CL——蒸煮损失，%；

G1——样品蒸煮前的质量，g；

G2——样品蒸煮后的质量，g。

1.2.5 持水性测定 将样品切成圆柱，称其质量，用滤纸包裹于离心管中，3 000 r/min离心10 min后称重。持水率按式(2)计算[13]：

(2)

式中：

WH——持水率，%；

m1——样品离心前的质量，g；

m2——样品离心后的质量，g。

1.2.6 白度测定 用色差计测定样品L*、a*、b*值。每组测量重复5次以上。白度(whiteness，W)按式(3)计算[14]：

(3)

1.2.7 鱼糜制品凝胶强度的测定 将鱼糜制品切成圆柱体，用质构分析仪分析其凝胶强度。设定参数：探头P/0.5，测前速度0.5 mm/s，测中速度1 mm/s，测后速度为10 mm/s，测量距离6 mm，触发力5 g，每组测量重复5次以上，结果取平均值[15]。

1.2.8 鱼糜制品的全质构分析 取制备的冻融鱼糜制品，室温下恒温2 h，切成直径3 cm、厚度2 cm的圆柱体，采用质构仪的TPA模型在室温下对样品进行检测，每组平行测定5次。设定参数：探头P/36R，测前速度3 mm/s，测试速度1 mm/s，测后速度3 mm/s，形变50%，触发力5 g。

1.2.9 蛋白质消化率

(1) 体外模拟消化试验：参照Wen等[16]和Escudero等[17]的方法测定蛋白质体外消化率。称取1.0 g 绞碎样品，加入4 mL磷酸缓冲液，冰浴状态下8 000 r/min重复2次匀浆，每次30 s；13 400 r/min重复2次匀浆，每次30 s，匀浆间隔30 s。1 mol/L HCl调节体系pH值为2.0±0.1，加入1 mL 胃蛋白酶溶液(0.48 g∶15 mL 0.1 mol/L HCl)，置于摇床上反应(37 ℃，反应时间2 h)。用1 mol/L的NaOH溶液调节体系pH值为7.5±0.1，加入1.0 mL胰蛋白酶溶液(0.288 g∶12 mL 0.01 mol/L pH值7.0的磷酸盐缓冲液)，置于摇床匀速摇晃反应(37 ℃，反应时间2 h)；沸水浴处理10 min 终止酶解反应。

(2) 蛋白质消化率的测定：按上述消化过程将两步消化后的酶解液加入无水乙醇静置12 h沉淀蛋白，离心15 min，弃去上清液，沉淀在50 ℃烘干至恒重。按式(4)计算消化率[18]。

(4)

式中：

DT——消化率，%；

W0——表示消化前样品中蛋白质含量，g；

W1——表示消化后烘干沉淀物中蛋白质含量，g。

1.2.10 感官评定 感官评定采用评分法，若干品评员针对滋味、组织状态、弹性和口感四方面进行评分，评价标准见表1(满分20分)。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼酶解产物常规成分分析

由表2可知，鲢鱼酶解产物蛋白质含量比较丰富，含量达到了85%。

2.2 鱼糜制品蒸煮损失和持水性变化

蒸煮损失指鱼糜在蒸煮过程中的损耗，持水性是鱼糜凝胶保留水分的能力，两者显示不同情况下凝胶对水分的持有能力。鱼糜凝胶结构越紧密，蒸煮损失越小，持水性越大[19]。

由图1可知：冻融前后加入酶解产物，鱼糜制品的蒸煮损失均降低，持水性均增加，添加酶解产物后降低蒸煮损失和提高持水性的原因是酶解产物具有较强的吸湿性，可以增强鱼糜对水分的吸收；此外，前期研究发现，该鲢鱼酶解产物中天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量相比原料有所升高，这些氨基酸具有与自由水相互作用及优先使易受攻击的蛋白质水合的能力[5]，从而增强了鱼糜凝胶持水性，降低了蒸煮损失[20]。

表1 感官评定标准

表2 鲢鱼酶解产物的常规成分含量

酶解产物加入量为2%时，其抑制蒸煮损失和增加持水性方面略优于4%和6%酶解产物添加组的，且2%酶解产物组与商抗组差异不显著(P>0.05)。冻融前后2%酶解产物添加组蒸煮损失与空白组相比，分别降低了37.20%和43.40%；冻融前后的持水率与空白组相比，分别增加了0.93% 和2.20%。其原因可能是酶解后产生了较多分子量较低的酶解产物组分及游离氨基酸[21]，一方面这些物质通过氢键等与鱼糜肌原纤维蛋白相互作用对其有抗冻保护作用，另一方面高浓度小分子物质的添加可能阻碍了肌原纤维蛋白形成稳定的凝胶网络结构，从而使得4%和6%酶解产物添加组的蒸煮损失增加、持水性降低。

2.3 鱼糜制品色泽的变化

鱼糜冷冻贮藏过程中，由于蛋白质变性造成鱼糜亮度降低，脂肪氧化产生的自由基等中间代谢产物则导致鱼糜色素降解、褐变等。如图2所示，冻融处理后所有样品的白度值都有所降低，但商抗添加组的白度值变化不明显(P>0.05)，而冻融处理后2%酶解产物组和商抗组的差异并不显著(P>0.05)，说明酶解产物具有的抗冻性[5]和抗氧化性[7]，在冻融过程对于鱼糜制品色泽的劣变有抑制作用；由于鲢鱼酶解产物本身呈现淡黄色，4%和6%酶解产物添加组冻融前后随着其添加量越大，鱼糜的白度值越低。

不同小写字母表示不同试验组之间差异显著(P<0.05)

2.4 鱼糜制品凝胶强度的变化

凝胶强度是判断鱼糜品质好坏的重要指标，对鱼糜制品的口感等品质及价格有决定性作用[22]，而鱼糜凝胶强度取决于肌原纤维蛋白组成的三维网状结构的强度。通过测定冻融前鱼糜制品的凝胶强度发现(图3)，冻融后，每组样品的凝胶强度都有所降低，冻融过程中肌原纤维蛋白的变性造成了凝胶强度的降低，但2%酶解产物添加组的凝胶强度明显高于空白组的(P<0.05)，添加6%酶解产物后反而降低了鱼糜制品的凝胶强度，说明适量的鲢鱼酶解产物可提高鱼糜制品的凝胶强度；2%酶解产物组与商抗添加组的凝胶强度差异不显著(P>0.05)。酶解产物可能与冷冻时形成的冰晶结合，阻止冰晶进一步变大，保护了肌原纤维蛋白因冰晶长大而导致的变性[23]；酶解产物也可能与蛋白通过疏水相互作用、氢键等直接作用，在冷冻时对鱼糜蛋白起到保护作用[24]。

2.5 鱼糜制品的全质构分析

鱼糜制品的全质构分析结果见表3。结果表明，冻融过程中，肌原纤维蛋白一定程度的变性导致鱼糜品质有所降低；但冻融后2%，4%酶解产物添加组和商抗添加组的硬度、弹性、内聚性回复性均明显优于空白组的，表明一定浓度的酶解产物及商业抗冻剂对鱼糜制品的凝胶品质具有较好的保护效果。

2.6 蛋白质消化率的变化

蛋白质消化率是反应蛋白质在消化道内分解的指标，是评价食物蛋白质营养价值的重要指标之一[24]。如图4所示，冻融后各组的蛋白质消化率均有所下降，空白组蛋白质消化率下降了55.44%，而2%酶解产物添加组的蛋白质消化率在冻融后略高于商抗组的，下降程度为47.02%，与空白组差异显著(P<0.05)。冻融后蛋白质消化率的降低，可能与蛋白质冷冻变性的机理有关。主流观点认为，冻结或冻藏过程中冰晶的形成引起蛋白质极性基团周围的水化层被破坏，导致肌原纤维蛋白高级结构改变(如折叠展开或聚集)和功能丧失[2-3]。理论上来说，蛋白质展开有利于蛋白质消化酶和底物的接触，从而有可能导致蛋白质消化率的增加，本研究中，各组蛋白质消化率均下降，说明在鱼糜制品中蛋白质的变性遵循的可能是变性展开再聚集的途径，酶解产物的添加降低了肌原纤维蛋白的变性程度，从而减少了其消化率的下降程度。

表3 鱼糜产品全质构分析†

† 同列不同小写字母表示不同试验组之间差异显著(P<0.05)。

不同小写字母表示不同试验组之间差异显著(P<0.05)

2.7 鱼糜制品的感官评定

感官评定进一步表征了鱼糜制品在冻融前后的食用品质，结果见表4。冻融后鱼糜制品感官评定评分都下降，冻融循环影响最大的是样品的组织状态(如图5所示)，空白组和6%酶解产物添加组制品的横截面呈海绵状，从而导致弹性和口感均下降；酶解产物的加入对样品滋味有一定的影响，过量会有异味，颜色偏黄；而商业抗冻剂的加入，导致产品有明显的甜味，破坏了鱼糜制品特有的鱼香风味；从感官评定结果可知2%酶解产物添加组在冻融前后得分均较高。

表4 鱼糜制品的感官评定结果

3 结论

通过综合对比添加了不同量鲢鱼酶解产物(0%，2%，4%，6%)的鱼糜制品冻融前后品质(蒸煮损失、持水性、白度、凝胶强度、全质构及感官品质等)及体外蛋白消化率的变化可知：鱼糜制品中添加2%的酶解产物可以增加鱼糜凝胶持水性，降低蒸煮损失，并且不会导致鱼糜制品带上酶解产物本身的淡黄色；同时，2%酶解产物添加组能有效减缓鱼糜制品凝胶强度、硬度和弹性的降低及其蛋白质消化率的下降程度；感官评定中2%酶解产物添加组在冻融前后均得分较高，酶解产物的添加避免了商抗给产品带来的明显甜味。该研究表明，鲢鱼酶解产物可作为潜在的抗冻剂应用于鱼糜及其制品的工业化生产，但长期冻藏过程中鲢鱼酶解产物在鱼糜及其制品中的抗冻性及其抗冻机理有待进一步研究。