鸡源细菌中5种四环素耐药基因多重PCR检测方法的建立

白 龙邵 毅黄柳娟冯 博周昌艳索玉娟白亚龙林 淼

BAI Long1,2 SHAO Yi1,3 HUANG Liu-juan1 FENG Bo1 ZHOU Chang-yan1,3 SUO Yu-juan1 BAI Ya-long1 LIN Miao1

(1. 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2. 上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；3. 上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403)

(1. Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China; 2. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai 201403, China)

四环素(tetracycline，tet)作为一种广普类抗生素，在禽畜养殖场中被大量使用[1]，导致病原菌产生耐药性[2]。研究表明，中国肉鸡中多种致病菌对四环素类抗生素已经产生了很高的耐药性[3-5]。因此，禽源四环素耐药菌的控制迫在眉睫。大量证据[6-8]表明，数量庞大的非致病菌可以是耐药基因的供体、受体和中间体，因此，近年来，在全细菌范围内研究抗生素耐药性的污染特征和耐药基因的水平迁移规律，成为揭示耐药性发生机制的新途径[9]。然而，关于在整个细菌范围内进行耐药基因的筛查研究，现有试验[10-12]大多基于单重或不多于三重的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)而展开，工作量非常大。因此，亟需开发耐药基因的快速筛查技术。

细菌对四环素的耐药机理主要分为主动外排蛋白(涉及的耐药基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetZ、tetJ、tetK、tetL、tetV等)、核糖体保护蛋白(tetM、tetO、tetS、tetW、tetT)、灭活或钝化四环素酶(tetX、tet34、tet37)[13]。其中tetA、tetD、tetG、tetS和tetX是鸡肉中较多检出的四环素耐药基因[5]，且涉及了3种四环素耐药机制。目前，对这5种四环素耐药菌的多重PCR同时检测技术尚未见报道。因此，本研究在已有的多重PCR技术开发经验[14-16]基础上，通过优化引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度和退火温度等因素，建立了同时检测tetA、tetD、tetG、tetS和tetX的五重PCR体系，为禽源四环素耐药基因的大规模筛查研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

四环素耐药基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT和tetX，以及磺胺耐药基因sul1和sul2片段的阳性克隆：本实验室克隆构建并保存[17]；

禽源四环素耐药菌克隆：本实验室筛查、鉴定并保存[5]；

TakaraExTaq酶：5 U/μL，不含Mg2+，宝日医生物技术(北京)有限公司；

dNTP Mixture：各2.5 mmol/L，宝日医生物技术(北京)有限公司；

MgCl2：25 mmol/L，宝日医生物技术(北京)有限公司；

PCR引物(表1)：10 μmol/L，生工生物工程(上海)股份有限公司；

脑心浸液肉汤培养基(Brain heart infusion broth, BHI)、LB培养基和琼脂粉：英国 Oxoid公司；

GelStain凝胶电泳染料、2K DNA marker、琼脂糖、6×DNA Loading Buffer、50×TAE电泳缓冲液、氨苄西林(Ampicillin，Amp)、双蒸水(dd H2O)： 北京全式金生物技术有限公司；

四环素：美国药典级，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

PCR仪：T100型，美国Bio-Rad公司；

电泳仪：Powerpac Universal型，美国Bio-Rad公司；

凝胶成像分析系统：GelDoc XR+Imager型，美国Bio-Rad公司；

电泳槽：DYCP-31E型，北京六一生物科技有限公司；

微量移液枪：Research Plus型，德国Eppendorf公司；

高速冷冻台式离心机：Centrifuge 5424 R型，德国Eppendorf公司；

超净工作台：SW-CJ-2FD型，苏州安泰空气技术有限公司；

摇床：TQ2-312型，上海精宏实验设备有限公司；

电热恒温培养箱：DHG-9203A型，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 四环素耐药基因片段阳性克隆DNA模板的制备

根据夏乐先等[21]和刘宗保[22]的方法修改后制备四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS和tetX片段阳性克隆的DNA模板。菌株用含100 μg/mL Amp的LB液体培养基增殖8 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min离心3 min，弃去上清液，无菌条件下加入2 mL生理盐水，振荡悬浮混合均匀，再用生理盐水依次10倍梯度稀释至10-1～10-8，依次取200 μL 稀释菌液均匀涂布于固体LB培养基上，37 ℃过夜培养，菌落计数并计算对应稀释液的活菌数，同时，依次取2 mL 稀释菌液悬浮3 min，沸水浴 10 min后立即冰浴15 min，即得粗提DNA，-20 ℃保存，作为PCR反应的模板。

表1 四环素耐药基因引物

1.2.2 多重PCR预试验

(1) 单重PCR灵敏性试验：以5种四环素耐药基因片段阳性克隆的粗提DNA为模板，进行单重PCR并用琼脂糖凝胶电泳观察结果，结合稀释菌液计数结果，初步确定5种耐药基因的单重PCR灵敏性。

(2) 多重PCR预试验：根据单重PCR的灵敏性，对5种耐药基因阳性克隆稀释菌液分别选择合适的稀释浓度下的粗提DNA模板，等比例混合后作为多重PCR的模板，进行多重PCR扩增反应。

(3) 反应体系：混合DNA模板5 μL，Taq酶0.25 μL，每种基因的正向引物和反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反应缓冲液5 μL，最终用 dd H2O补齐至50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。以去离子水为模板作阴性对照。琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.3 多重PCR参数优化

(1) 引物浓度的优化：在预试验的基础上，根据各基因PCR扩增产物的长度，按照表2进行引物浓度优化试验。

(2)Taq酶浓度的优化：在引物浓度优化结果的基础上优化Taq酶的浓度，在多重PCR反应体系中分别添加0.25(1.25 U)，0.50 (2.50 U)，1.00 (5.00 U)，1.50 μL(7.50 U)Taq酶，考察Taq酶浓度对扩增效果的影响。

(3) 退火温度的优化：依次选取53，55，57，58 ℃作为退火温度，进行多重PCR反应体系退火温度的优化试验。

表2 多重PCR体系引物浓度的优化

1.2.4 多重PCR的灵敏度和特异性分析 在多重PCR参数优化的基础上，对混合DNA模板进行10倍梯度稀释(10-1，10-2，10-3)，考察多重PCR方法的灵敏度。粗提耐药基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT、tetX、sul1和sul2片段阳性克隆菌株的DNA，以优化的反应条件和体系进行PCR，检测该多重 PCR方法的特异性。

1.2.5 禽源四环素耐药菌的5种耐药基因检测 23株已鉴定四环素耐药基因携带情况的禽源四环素耐药菌(表3)在含有16 μg/mL四环素的BHI液体培养基活化后粗提DNA，分别用上述优化后的多重PCR体系进行耐药基因的检测，验证方法的实用性。

表3用于验证多重PCR方法实用性的23株禽源四环素菌

Table3 23 strains of poultry tetracycline resistant bacteria used for verify the utility of multi-PCR system

菌株序号携带四环素耐药基因种属革兰氏染色特性1tetABrochothrix thermosphactaG+2tetAStenotrophomonas spG-3tetA、tetSlactic acid bacteriumG+4tetA、tetDSphingobacterium spG-5tetDMacrococcus caseolyticusG+6tetSCarnobacterium spG+7tetXAeromonas spG-8tetA、tetDKurthia spG+9tetA、tetDPseudomonas spG-10tetA、tetDAeromonas spG-11tetA、tetDBrochothrix thermosphactaG+12tetSMacrococcus caseolyticusG+13tetXStaphylococcus spG+14tetSAcinetobacter spG-15tetAPseudomonas spG-16tetSCarnobacterium spG+17tetS、tetXMyroides marinusG-18tetSMacrococcus caseolyticusG+19tetA、tetSCarnobacterium spG+20tetSCarnobacterium spG+21tetSCarnobacterium spG+22tetSCarnobacterium spG+23tetS、tetXSphingobacterium spG-

2 结果与分析

2.1 单重PCR灵敏性试验结果

用梯度稀释菌液的粗提DNA作为模板，对5种耐药基因进行单重PCR扩增(图1)。选择比目的条带可见的稀释梯度高1～2个梯度的稀释度，即tetA10-4、tetX10-4、tetG10-3、tetD10-4、tetS10-4，作为多重PCR中混合DNA的模板稀释度。稀释菌液的平板计数结果表明，tetA、tetX、tetG、tetD、tetS阳性克隆菌株菌悬液原始浓度为5.1×108，7.6×108，4.3×107，4.5×108，9.2×108CFU/mL，再将各被选中的DNA模板稀释5.1，7.6，4.3，4.5，9.2倍，制成104CFU/mL的菌液DNA粗提物，等比混合后获得用于开发多重PCR方法的DNA模板。

在多重PCR体系中，随着检测基因位点的增多，即引物数量的增加，每条目的基因的扩增效率会受到影响，某种特异性条带优先进行PCR反应，而部分条带甚至无法获得扩增[23]。在本研究中也出现了类似的情况，当多种DNA模板和引物混合反应后，部分在单重PCR中能够顺利扩增的条带不再呈现目的条带。采取阶梯增加引物的策略，调整新加入的引物浓度直至获得扩增，使得PCR体系从一重增加至五重(图2)。但用该体系和程序对实际细菌样品进行5种耐药基因的筛查时，发现部分基因无法扩增，因此需要优化多重PCR的反应体系及反应程序。

图1 不同稀释度DNA粗提液的单重PCR扩增结果

Figure 1 The amplification of five tet genes in single PCR with diluent templates

M. 2 K Maker 1. 四环素耐药基因五重PCR扩增条带 -. 阴性对照

图2 多重PCR预试验扩增结果

Figure 2 Preliminary amplification of multiple PCR

2.2 多重PCR条件优化

2.2.1 引物浓度 当tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物浓度分别为0.1，0.1，0.2，0.2，0.2 μmol/L(即5对引物的单条引物添加量分别为0.5，0.5，1.0，1.0，1.0 μL，浓度比为1∶1∶2∶2∶2，图3，泳道3)时，5个目的基因的扩增条带亮度相近，均能得到比较好的扩增且无非特异性条带。

2.2.2Taq酶浓度 当多重PCR体系中的Taq酶添加量为1 μL(即Taq酶的终浓度为0.1 U/μL)时，5条目的条带最为清晰(图4，泳道3)。

2.2.3 退火温度 对多重PCR反应的退火温度进行优化，结果表明，当退火温度高至58 ℃时(图5)，部分条带不再扩增，因此选择55 ℃作为多重PCR的退火温度。

综上，优化后的多重PCR反应体系为：混合DNA模板5 μL，Taq酶1 μL，tetA和tetX的正反向引物各0.5 μL，tetG、tetD和tetS的正反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反应缓冲液5 μL，最终用 dd H2O补至50 μL。反应程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

M. 2 K Maker 1～5.tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物浓度比分别为1∶1∶1∶1∶2，1∶1∶1∶2∶2，1∶1∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶4 6～10. 1～5组的阴性对照

图3 不同浓度的引物进行多重PCR扩增

Figure 3 Amplification of multiple PCR using primers with different concentrations

M. 2 K Maker 1～4.Taq酶添加量分别为0.25，0.50，1.00，1.50 μL 5～8. 1～4组的阴性对照

图4 多重PCR体系中添加不同体积Taq酶的扩增结果

Figure 4 Amplification of multiple PCR usingTaqwith different concentrations

M. 2 K Maker 1～4. 退火温度分别为53，55，57，58 ℃ 5～8. 1～4组的阴性对照

图5 不同退火温度对多重PCR扩增的影响

Figure 5 Amplification of multiple PCR with different annealing Temperature

2.3 多重PCR的灵敏度和特异性

为了确定多重PCR体系的灵敏度，基于优化的PCR扩增条件和反应程序，将含104CFU/g菌落的粗提DNA混合模板稀释成10.00%，1.00%，0.10%分别进行扩增。结果表明，当混合DNA模板被稀释到0.10%时，使用本方法已检测不到tetS基因，而1.00%的稀释模板仍能扩增出所有5条目的条带(图6)。因此，本多重PCR反应的灵敏度为102CFU/g。

以13种耐药基因的阳性克隆菌株的粗提DNA为模板，用优化的多重PCR体系进行扩增，考察体系的特异性。结果表明，本方法仅可以检测5种目的耐药基因，对不含目的耐药基因的样品无法扩增出条带(图7)。因此本多重PCR体系具有较好的特异性。

M. 2 K Maker 1～4. 模板稀释梯度分别为10-3，10-2，10-1，1005～8. 1～4组的阴性对照

图6 不同稀释梯度的混合DNA模板的多重PCR扩增结果

Figure 6 Amplification of multiple PCR using templates with different dilutions

1～16. 分别以tetA、tetA+tetD、tetA+tetG、tetS、tetX、sul1、sul2、tetE、tetM、tetT、tetO、tetR、tetA+tetX、tetA+tetS、tetA+sul1、tetA+tetX+tetS的阳性克隆菌为模板进行PCR扩增的样品 M. 2 K Maker -. 阴性对照

图7 特异性验证结果

Figure 7 Specificity of the multi-PCR system

2.4 禽源四环素耐药菌的耐药基因检测

用建立的多重PCR体系和反应程序检测23株本实验室筛查获得并鉴定保存的禽源四环素耐药菌，检测结果与普通单重PCR检测结果完全一致(表3，图8)。23株禽源耐药菌属于11个种属，包括肉杆菌(Carnobacteriumsp)、溶酪大球菌 (Macrococcuscaseolyticus)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp)、气单胞菌(Aeromonassp)、假单胞菌(Pseudomonassp)、热死环丝菌(Brochothrixthermosphacta)、库特氏菌(Kurthiasp)、寡养单胞菌(Stenotrophomonassp)、乳酸菌(lacticacidbacterium)、海洋类香味菌(Myroidesmarinus)、不动杆菌(Acinetobactersp)，且既有革兰氏阴性菌又有革兰氏阳性菌。因此，本研究建立的多重PCR体系能广谱地应用于禽源细菌的5种耐药基因筛查检测。

M. 2 K Maker 1～23. 实验室筛查获得并鉴定的四环素耐药菌菌株 -. 阴性对照

图8 用多重PCR筛查23株四环素耐药菌中5种四环素耐药基因的存在情况

Figure 8 Screening of five tetracycline resistance genes by multi-PCR system in 23 poultry isolates of tetracycline resistant bacteria

3 结论

本试验通过优化四环素耐药基因引物的浓度、TaqDNA聚合酶浓度和退火温度等因素，建立了可以同时检测5种四环素耐药基因tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的多重PCR方法，灵敏度为102CFU/mL，可用于鸡源革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中四环素耐药基因的快速筛查。目前已发现40多种四环素耐药基因[1]，且在鸡肉产品[5]和饲养环境[24-25]中还存在除本研究所涉5种基因以外的其他多种四环素耐药基因，因此，还需继续开发其他禽源四环素耐药基因的多重PCR检测技术，以满足细菌中四环素耐药基因的大规模筛查研究的需求。